中医视角下的慢性肾脏病-矿物质骨代谢异常

王小琴 王岚

430061 武汉，湖北省中医院/湖北省中医药研究院/湖北中医药大学附属医院肾病内科(王小琴)；430061 武汉，湖北中医药大学第一临床学院(王岚)

慢性肾脏病(CKD)因其高发病率、高致残率、高医疗费业已成为危害全球人类健康的公共卫生问题。矿物质骨代谢异常(mineral and bone disorder，MBD)作为CKD3-5期继发的严重并发症，其发病机制尚未完全阐明。尽管活性维生素D、磷结合剂、拟钙剂等药物以及甲状旁腺手术等在CKD-MBD中得到广泛应用，但MBD仍然是导致CKD患者继发心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)甚至死亡的主要危险因素[1]。中医认为人体骨骼生长发育与肾脏的关系最为密切，提出了“肾主骨”理论，并在长期的临床实践中得到验证。但如何运用现代医学知识理解它、用分子生物学技术解析它，通过中西医理念与技术的整合互补，深入研究(chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)的发病机制及治疗手段，是一个值得深入探讨的问题。

一、“肾主骨”理论的起源及意义

中医理论认为人体骨骼的生长发育与肾脏的关系最为密切，这一理论思想首次出现在成书于公元前一世纪的《黄帝内经》中。《黄帝内经》的第一章《素问 上古天真论》指出，“女子七岁，肾气盛，齿更发长……三七，肾气平均，故真牙生而长极。四七，筋骨坚，发长极，身体盛壮”。“丈夫八岁，肾气实，发长齿更……三八，肾气平均，筋骨劲强，故真牙生而长极；四八，筋骨隆盛，肌肉满壮；五八，肾气衰，发堕齿槁……七八，肾藏衰，形体皆极；八八，则齿发去。” 首次认识到生命的生长规律与骨骼的发育周期高度一致，而这一过程由肾脏产生的精气所主宰，即所谓“肾藏精而主骨”[2-3]，简称“肾主骨”理论。

肾藏精而主骨有两重涵义。从广义的角度说，肾中藏有精气。肾精包括先天之精和后天之精，它部分取决于先天禀赋和遗传因素，部分来源于后天环境的补充。肾精是人生长、发育、生殖和各种功能活动(包括骨骼发育)的物质基础。肾精生成肾气，肾气分为肾阴和肾阳。肾阳促进和推动生长，肾阴则滋养和濡润各器官。二者相互制约，相互依存，其中的精细调控保证身体机能处于不断变化但又时刻平衡的状态。肾精的虚损或阴阳平衡的破坏可以直接影响各种慢性疾病的发展，并加速人的衰老。从狭义的角度说，肾精对骨骼的发育极其重要。肾中精气充盈，才能充养骨髓，强壮骨质。小儿囟门迟闭，骨软无力，以及老人骨质疏松，易于骨折，都与肾中精气不足有关。

基于这个理论，中国的历代医家多注重采用补肾益精法治疗各种骨骼疾病和慢性病，并用于延缓衰老，已取得了满意的临床疗效。例如，具有补肾强骨作用的骨碎补，能促进骨折愈合，改善骨折相关症状。具有补肾阳作用的黄芪、仙茅、淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉、杜仲、补骨脂、菟丝子、续断，以及具有补肾阴作用的女贞子等中草药对骨质疏松具有一定的治疗作用[4]。在发生骨折的最初6个月内，采用中医药治疗的患者，与非中药治疗者相比，症状改善加快，住院医疗花费减少，而且合并冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、高血压及脑卒中患者的发病率明显降低[5-6]。临床采用具有补肾壮骨功效的中草药治疗CKD，发现其疗效机制与调节钙磷代谢有关。Chung-Yu Huang等[7]在中国台湾进行了一项关于2型糖尿病患者使用中医药的流行病学研究，从1998至2008年间随机抽取的100万人中包含40 136例2型糖尿病病例，其中31 289例(78.0%)至少一次在门诊使用过中医药，4 351例(10.8%)使用中医药为主治疗糖尿病。在排名前几名的中药处方中，包括知柏地黄丸、杞菊地黄丸、济生肾气丸、八味肾气丸，它们几乎全部由六味地黄丸衍生而来，而六味地黄丸是公认的补肾名方；较多临床及实验研究证实其具有调节钙磷代谢、促进骨骼生长的作用[7-8]。

二、“肾主骨”与肾-骨内分泌轴

肾藏精而主骨是一个古老的理念，在长期的临床实践中已得到了验证。但是，如何运用现代医学的生化知识和分子机制来理解它，一直是一个值得探讨的问题。肾脏作为活性维生素D生成的主要场所、骨骼作为调磷激素生成的重要器官，两者通过分泌众多内分泌因子并相互应答，在维护机体钙磷稳态中起关键作用。如骨形成蛋白7(BMP-7)作为肾-骨连接的信号因子，虽然在促进肾脏和成骨细胞发育过程中起重要作用，而在CKD中，BMP-7减少可加速肾脏、骨骼病变及血管钙化的进展[9]。近年来，肾-骨内分泌轴的发现，对我们理解“肾主骨”理论提供了进一步的线索。这个肾-骨对话是通过骨骼分泌的成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor，FGF23)和肾脏合成的α-klotho(以下简称Kl)基因来实现的。

1997年Kuro-o等[10]首次发现Kl在肾脏强表达，其编码的Kl蛋白位于肾小管上皮细胞膜上，为膜型Kl，而胞外结构域被剪切后进入血液循环，成为可溶性Kl(soluble Kl，sKl)。Kl基因缺陷动物表现出骨质疏松、生长缓慢、异位钙化及早衰等[11]。2000年White等[12]首次在常染色体显性遗传佝偻病(ADHR)患者体内发现由骨骼分泌的FGF23的基因变异，导致其裂解障碍而使循环中FGF23升高，引起低磷血症、骨质疏松、异位钙化及矮小症等。这些研究发现Kl与FGF23基因缺陷表型相似，提示两者之间存在共同的信号传导路径。Urakawa等[13]通过研究发现Kl与FGF23存在受体与配体关系，从此开启了骨-肾内分泌轴研究的序幕。随后不断有报道证实，肾小管上皮细胞分泌的膜型Kl经FGF受体1(FGF receptor，FGFR 1)自身携带的络氨酸激酶介导，与FGFR1结合形成Kl/FGFR1二元复合物；经细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化介导，与FGF23结合形成Kl/FGFR1/FGF23三元复合物；通过诱导肾脏24-羟化酶(CYP24)表达，抑制α羟化酶(CYP27B1)表达，平衡活性维生素D的生成与降解，并调节甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的释放，从而在肾-骨-甲状旁腺之间形成一个正负反馈调节环路，将细胞外钙磷浓度控制在一个精确的范围。在CKD患者中，因肾脏结构和功能受损，Kl表达下降，对FGF23的应答减弱，钙磷平衡的调节机制被打断，最终导致骨骼异常矿化和血管异位钙化[14]。

目前有多种假设解释骨骼分泌FGF23的启动机制。Knab等[15]采用C57BL及ADHR小鼠模型，给予PTH皮下注射，发现2 h后血C端-FGF23片段(C-terminal FGF，cFGF23)及全段FGF23(Intact FGF，iFGF23 )较假注射组显著升高，但在2 h后即开始下降，特别是在6 h后，iFGF23的下降与PTH呈剂量依赖关系；小鼠股骨FGF23mRNA、骨骼裂解液FGF23蛋白表达，在注射PTH 2 h后明显增强，但随着时间延长逐渐减弱，说明PTH参与调节骨骼分泌FGF23的作用极为有限。Andrukhova等[16]采用膜型Kl单基因和膜型Kl/FGF23双基因敲除小鼠，给予sKl或联合重组FGF23，均不能诱导动物模型钙磷浓度的变化，说明sKl不能代替膜型Kl与FGF23产生应答效应。血磷作为肾-骨环路中的效应因子，同时又是重要的主动调节因子。较多的研究表明，升高血磷能明显诱导骨骼分泌FGF23，进一步的研究证实，其作用机制是在转录后对FGF23的表达进行调控，而非诱导FGF起始转录；虽然在细菌和酵母菌中已经发现磷感受体(磷结合蛋白PstS)参与调节细胞内外钙磷浓度，但尚未在人体证实骨骼细胞的磷感受体[17]。1，25(OH)2VitD3作为Kl/FGFR1/FGF23复合物调控的下游产物，在肾脏合成分泌后进入血液循环，通过与靶器官细胞核中配体依赖性维生素D受体(VDR)结合，发挥多种生物学效应。其中在肠道1，25(OH)2VitD3与VDR结合，促进钙磷吸收，在骨骼则调节矿化动态平衡；研究表明循环1，25(OH)2VitD3升高能明显诱导骨骼FGF23表达增加[18]。这些研究说明FGF23的合成与分泌受多种因素调控，其中1，25(OH)2VitD3与骨骼的相互应答是核心环节。

1，25(OH)2VitD3在肾脏合成分泌后进入循环，通过与靶器官细胞核中配体依赖性VDR结合，发挥多种生物学效应。其中在肠道1，25(OH)2VitD3与VDR结合，促进钙磷吸收，在骨骼则调节矿化动态平衡；研究表明循环1，25(OH)2VitD3升高能明显诱导骨骼FGF23表达增加[18]。当游离的1，25(OH)2VitD3以弥散方式进入细胞后，转移至核内，与VDR结合形成复合物，引起VDR磷酸化，转变为活化形式的VDR，与维甲酸受体(RXR)形成异二聚体，进一步与靶基因启动子区域VDR反应元件(VDREs)结合，从而启动靶基因转录。Yu等[19]采用VDR基因敲除小鼠模型，发现动物模型出现低磷低钙血症，而在血中几乎检测不到FGF23；在正常小鼠模型，经1，25(OH)2VitD3干预后，FGF23 mRNA表达升高80倍，经1，25(OH)2VitD3处理的骨肉瘤细胞FGF23 mRNA 增加78倍。Saini等[20]采用正常小鼠颅骨细胞及小鼠骨肉瘤细胞(UMR-106)作为模型，结果显示，经10 nmol/L浓度的1，25(OH)2D3处理的正常小鼠骨骼细胞FGF23 mRNA表达增加了5倍，而UMR-106细胞FGF23 mRNA增加了2 000倍以上；在所有被检测的转录因子中，VDRmRNA表达最为强烈；说明1，25(OH)2D3通过增加VDR蛋白及VDREs，刺激FGF23基因表达；进一步采用凝胶迁移技术(EMSA)对32P-标记的候选VDREs进行分析，结果表明VDR/RXR对1，25(OH)2D3的亲和性最强。这些研究证实骨骼通过核受体VDR/RXR对肾脏合成的1，25(OH)2D3做出应答，从而启动FGF23合成与分泌。肾骨甲状旁腺应答环路如图1所示。

三、中医理论指导下的CKD-MBD研究

因Kl基因表达下降所导致的MBD与肾精虚损所表现的发育迟缓、骨骼痿软、早衰等临床表型十分吻合，认为肾主骨是通过肾脏分泌的Kl与骨骼分泌的FGF23相互应答、共同完成的。在CKD中，因肾脏结构和功能受损，Kl基因表达下降，即肾精不足，肾气生成减少，主骨功能减弱，即Kl与骨骼分泌的FGF23应答障碍。阴阳失衡，则为 1，25(OH)2VitD3与 24，25(OH)2VitD3的生成与降解失衡，钙磷稳态调节机制被打乱，临床表现出肾虚骨弱之证，即肾性骨病。而浊毒内蕴，表现为血中FGF23升高、低钙高磷或高钙高磷血症、尿毒症毒素蓄积等。浊毒瘀血伤及血脉，脉络瘀阻，即为血管等软组织对FGF23产生了错误应答，导致血管钙化，最终引起CVD等致命并发症。有学者采用 PCR联合直接测序方法，对67例2型糖尿病引起的糖尿病肾脏病患者Kl-G-395A 位点单核苷酸多态性进行检测，以56 例 2型糖尿病非肾脏病患者及55 例健康志愿者作为对照。结果表明A等位基因是2型糖尿病继发肾脏病的独立危险因素；GA及AA 基因型是糖尿病肾脏病的易感基因；而A等位基因与脾肾阳虚证有显著的相关性[21]。

一项中药复方制剂天芪降糖胶囊(黄芪、天花粉、女贞子、石斛、人参、地骨皮、黄连(酒蒸)、山茱萸、墨旱莲、五倍子)治疗420例糖耐量异常患者的随机双盲对照研究表明，经12个月的治疗，中药组较安慰剂组患糖尿病的风险减少32.1%，说明补肾壮骨中药对糖尿病有一定的预防作用[22]。肾元颗粒由生黄芪、淫羊藿、酒制大黄组成，具有补肾壮骨、通腑泄浊功效[23]，随机对照临床研究表明其在改善CKD患者的临床症状、纠正低钙血症、稳定肾功能方面明显优于对照药物[24]。采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，以《中国药典》规定的黄芪、淫羊藿及酒大黄主要药性成分的单体标准品(黄芪甲苷、淫羊藿苷、大黄酚、大黄酸、大黄素)为对照，给予大鼠该复方中药灌胃，将含药血清与空白血清、标准品进行比较，结果显示该制剂吸收进入血液的药效物质主要包括淫羊藿苷、黄芪甲苷、大黄素等，其含量分别为0.87 μg/mL，0.76 μg/mL，13.6 μg/mL[25]。在高糖环境下，发现该含药血清能明显诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)Kl表达上调，协同增加FGF23诱导的Kl与FGFR1表达及共表达，调节下游CYP24、p-ERK1/2及 CYP27B1表达[26-27]。在链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及高磷饮食诱导的糖尿病肾病小鼠模型中，补肾壮骨、通腑泄浊中药能明显降低尿白蛋白排泄、降低血FGF23水平，纠正低钙高磷，其机制与增强肾脏Kl 与 FGFR1表达及共表达、抑制CYP24、CYP27B1 及p-ERK1/2表达有关；进一步观察到胸主动脉钙盐沉积减轻、胫骨骨膜下软骨细胞病变得到一定程度修复[28-29]。在5/6肾切除加高磷饮食大鼠模型中，Kl、BMP-7 mRNA及蛋白在肾皮质小管表达较正常组明显降低，与血钙浓度呈正相关，与血磷水平呈负相关；采用补肾壮骨、通腑泄浊中药干预后，血磷及碱性磷酸酶水平明显下降，肾脏Kl、BMP-7 mRNA及蛋白表达增加，骨密度得到明显改善[30-31]。这些研究证实在“肾主骨”理论指导下，采用的补肾壮骨、通腑泄浊法治疗CKD-MBD的作用机制，与增强肾脏Kl与骨骼FGF23之间的应答有关。

四、研究展望

尽管Kl与FGF23的应答机制能够部分解释肾主骨的科学内涵及CKD-MBD的发病机制，但Kl与FGF23调控的核心环节是平衡活性维生素D的生成与降解，而活性维生素D作用的靶器官除了骨骼以外还有肠道、甲状旁腺，因此，肾-肠-骨-甲状旁腺这一大内分泌轴在CKD-MBD发病机制中的调节机制仍有待阐明；BMP-7作为肾骨发育重要的调节因子，在CKD-MBD中确切的作用机制及与肾-骨轴的关系有待进一步研究；中医药疗法对CKD-MBD的作用靶点除了肾-骨轴外，对肾-肠-骨-甲状旁腺内分泌轴的影响也有待进一步探讨。希望在未来通过中西医理念与技术的整合互补，深入解析CKD-MBD的发病机制，发掘更有效的作用靶点，并基于这些靶点，开发安全有效、作用机制明确的中药制剂或中药有效成分，丰富中西医结合防治CKD-MBD的理论与实践。