四溴双酚A和四氯双酚A对非洲爪蛙蝌蚪的毒性效应

牛玥，朱敏，刘芃岩，秦占芬,*

1. 中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085 2. 河北大学化学与环境科学学院，保定 071002 3. 中国科学院大学，北京 100049

四溴双酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)和四氯双酚A (tetrachlorobisphenol A, TCBPA)作为阻燃剂在塑料、合成纤维等材料中广泛应用[1-3]。目前，TBBPA和TCBPA在多种环境介质、生物样品乃至人体样品中均有较高的检出率[4-9]。Liu等[10]分析了关于我国普通水体中TBBPA浓度的报道，认为平均浓度<10 ng·L-1。但在TBBPA污染严重的巢湖水体中，Yang等[11]检测到TBBPA浓度为850～4 870 ng·L-1。Wang等[12]的研究结果显示，TBBPA在污水中浓度最高可达19.3 μg·L-1。近几年，饮用水中TBBPA和TCBPA也被检出[13]。因此，TBBPA和TCBPA的安全性受到越来越多的关注。

资料显示，TBBPA与TCBPA对水生生物的毒性为中毒或极毒，远高于哺乳动物[14-17]。两栖动物是生物体由水生到陆生的过渡类型，被认为是生态环境监测的重要指示类群。目前，关于TBBPA和TCBPA对两栖动物毒性的数据还相对较少，未见相关急性毒性的报道。另外，化学品暴露一般会引起谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase, GST)、硫氧还原蛋白(thioredoxin, TRX)和过氧化氢酶(catalase, CAT)等几个氧化应激标记在转录水平或者酶活性的变化。曾有研究报道，低浓度的TBBPA影响斑马鱼体内CAT和GPX酶的活性及活性氧(ROS)的浓度[18-19]。巩文静等[17]报道，亚致死浓度下TBBPA导致太平洋真宽水蚤体内产生氧化应激。另外，热休克蛋白(heat shock protein, HSP)也是与氧化应激相关的参数，一些化学品也可影响HSP27、HSP70和HSP90等几个热激活蛋白的水平[20]。Hu等[18]报道高浓度的TBBPA影响斑马鱼体内hsp70基因的表达。

本文选择生态毒理学中常用的两栖类模式种非洲爪蛙，研究了TBBPA和TCBPA的急性毒性以及对氧化应激标记物的影响。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验动物

本实验室饲养的非洲爪蛙成年雌蛙和雄蛙，分养于盛有去氯自来水的玻璃缸中，每个玻璃缸大约10只成蛙，水温21～22 ℃，明暗光周期为12 h∶12 h。成蛙喂食猪肝和商品饲料，每周各1次，喂食2 h后换水。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黄体素释放激素(LHRH)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU。将雌雄蛙放于产卵容器中，置于黑暗、安静的环境中让其抱对，12 h左右即可产卵。受精卵在21～22 °C的去氯自来水中孵化，胚胎发育至48期的蝌蚪，进行暴露试验。

1.2 试剂与仪器

仪器和设备：高速冰冻离心机(Centrifuge 5430，Eppendorf，德国)；PCR仪(9700，Applied Biosystem，美国)；荧光定量PCR仪(MX3500P，Strata gene，美国)；组织碾磨仪(MM301，Retsch，德国)；涡旋混匀器(Vortex3000，Wiggens，美国)；全自动核酸提取仪(AU1001，北京百泰克生物技术有限公司，中国)；电子天平(JA2003B，上海越平科技仪器有限公司，中国)；移液器(Eppendorf，德国)；全自动凝胶成像仪(GBOX-HR，Syn Gene，英国)；普通PCR仪(My Cycler TM，Bio-Rad，美国)；电泳仪(DYCP-31F，北京六一仪器厂，中国)。

试剂：TBBPA(纯度97%，Acros公司，比利时；分子量543.88，CAS No.79-94-7)；TCBPA(纯度98%，梯希爱化成工业发展有限公司，中国上海；分子量336.06，CAS No.79-95-8)；二甲基亚砜(DMSO)(纯度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司，美国；CAS No. 67-68-5)；核酸染料(G-red)和RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，中国)；反转录试剂盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR试剂盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，中国北京)；PCR引物(华大基因，中国北京)。

1.3 蝌蚪急性毒性试验

TBBPA和TCBPA用助溶剂DMSO配成100 g·L-1的储备液。设置溶剂对照组，其中，溶剂的浓度与处理组溶剂浓度相同，溶剂的体积浓度不超过0.01%。暴露试验在玻璃缸里面进行，每个缸盛有1 L试验液，蝌蚪随机放入10尾。每隔24 h换一次水，清除死亡个体，记录死亡数，试验持续48 h。

在正式试验之前先对2种化学物质进行较大浓度范围(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的预试验，不设平行组，各浓度的缸中加入10尾蝌蚪，观察记录48 h蝌蚪死亡数。根据预试验得出的结果，设置正式试验浓度。正式试验以1.4为公比设置了7个浓度梯度(表1)和溶剂对照组，每组3个平行，每个缸中随机加入10尾蝌蚪；其他同预试验；重复2次正式试验。

表1 正式暴露实验中四溴双酚A(TBBPA)和四氯双酚A(TCBPA)的浓度Table 1 Concentrations of tetrabromobisphenol A (TBBPA) and tetrachlorobisphenol A (TCBPA) in exposure experiments

1.4 RNA提取和RT-qPCR实验

每个缸随机取2尾蝌蚪，用全自动核酸提取仪提取RNA，超微量分光光度计(51119500C，Thermo Fisher Scientific，美国)测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳来确定RNA完整性。然后根据Fast Quant RT Kit(with g DNase)说明书配制20 μL反应体系进行反转录。

根据SYBR Green PCR Kit说明，配制10 μL反应体系进行RT-qPCR实验。PCR程序为：95 ℃预变性15 min，40个循环扩增(95 ℃变性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每个基因在使用之前都进行了扩增效率的验证，计算公式为E=(10-1/slope-1)×100。扩增效率在90%～110%之间，溶解曲线单一且重合，不存在非特异性扩增的基因才可用于后续实验。进行基因表达分析时，以rpl8为管家基因对各个基因的表达进行标准化[21]。基因的相对表达量根据公式2-ΔΔCT计算[22]。引物及相关信息如表2所示。

表2 RT-qPCR引物及相关信息Table 2 Primers sequences and relevant information on RT-qPCR

1.5 数据统计与分析

用SPSS 16.0进行数据分析。统计单元为缸，即n值等于平行缸数[21]。重复2次正式试验，得到相似的结果，在文中只呈现其中一次的试验数据[23]。回归分析使用Probit模型，建立“剂量-效应”线性方程，并计算半数致死浓度(LC50)值及其95%置信区间。统计数据均以平均值±标准误(standard error of mean, SEM)表示。暴露组中以各自的参照相比的显著性差异采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05认为有显著性差异。

2 结果(Results)

2.1 TBBPA与TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性

溶剂对照组无死亡，表明试验质量控制良好。TBBPA和TCBPA暴露组蝌蚪的死亡率变化如图1所示。24 h时，6.00mg·L-1TBBPA和8.00 mg·L-1TCBPA暴露组的蝌蚪存活率均为0。3.06 mg·L-1和4.28 mg·L-1的TBBPA暴露组蝌蚪的存活率分别为97%和53%，4.08 mg·L-1和5.71 mg·L-1的TCBPA暴露组蝌蚪的存活率分别为27%和10%，其他浓度暴露组的蝌蚪均无死亡现象发生。48 h时，全部暴露组蝌蚪的存活率均未发生改变。观察蝌蚪死亡现象时发现，6 mg·L-1TBBPA暴露组加入TBBPA后，蝌蚪沉到水底，不再游动，24 h后全部死亡，8 mg·L-1TCBPA暴露组蝌蚪的死亡现象同6 mg·L-1TBBPA暴露组。4.28 mg·L-1TBBPA与5.71 mg·L-1TCBPA暴露组存活蝌蚪的心脏与尾部周围观察到明显的凝血现象，TBBPA和TCBPA的浓度分别低于3.06 mg·L-1和2.92 mg·L-1时不再发生凝血现象。

图1 TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪存活率的影响Fig. 1 Effects of TBBPA and TCBPA on survival rates of Xenopus laevis tadpoles

经统计分析得到TBBPA和TCBPA对蝌蚪的24 h-LC50分别为4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1，48 h-LC50与24 h-LC50相同(表3)。TBBPA与TCBPA的毒性相当。

表3 TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的半数效应浓度(LC50)及其95%置信区间和回归方程Table 3 The median lethal concentration (LC50), 95% confidence interval and regression equations of TBBPA and TCBPA to Xenopus laevis tadpoles

2.2 TBBPA与TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪体内氧化应激相关基因转录的影响

RT-qPCR结果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA显著上调蝌蚪体内gst和trx这2种基因的转录水平，呈线性剂量-效应关系(图2)。3.06 mg·L-1TBBPA暴露组与2.92 mg·L-1TCBPA暴露组蝌蚪体内gr基因的转录水平被显著促进。0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA蝌蚪体内cat和gpx基因的转录水平呈倒“U”型趋势，0.79 mg·L-1和1.12 mg·L-1TBBPA暴露组和1.06 mg·L-1TCBPA暴露组蝌蚪体内的cat和gpx基因的相对表达量被显著上调。

图2 TBBPA(a)和TCBPA(b)对非洲爪蛙体内氧化应激标记基因转录的影响注：*P<0.05，与对照组相比。Fig. 2 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on oxidative stress marker genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.3 TBBPA与TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪体内热休克蛋白转录的影响

RT-qPCR结果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA对蝌蚪体内的hsp27基因的转录水平无显著性影响(图3)。TBBPA及TCBPA暴露组蝌蚪体内hsp70和hsp90基因的转录水平与TBBPA及TCBPA暴露浓度呈“倒U型”关系，且TBBPA浓度为1.12 mg·L-1时，蝌蚪体内hsp70和hsp90的转录水平被显著上调；当TCBPA浓度为1.06 mg·L-1时，蝌蚪体内hsp90的转录水平被显著上调。

图3 TBBPA(a)和TCBPA(b)对非洲爪蛙体内热休克蛋白转录的影响注：*P<0.05，与对照组相比。Fig. 3 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on heat shock protein genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.4 TBBPA与TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪体内凝血基因转录的影响

TBBPA和TCBPA暴露组蝌蚪心脏与尾部出现凝血现象(图4)。因凝血现象的出现，选择f2、f10和serpina基因作为指标，探究TBBPA与TCBPA对蝌蚪体内凝血基因转录水平的影响。研究发现，暴露于TBBPA和TCBPA 48 h后，凝血基因f2、f10和serpina的表达有一定的变化趋势(图5)：0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA促进蝌蚪体内凝血基因f2、f10和serpina的转录水平，呈线性剂量-效应关系，并在3.06 mg·L-1表现出显著性差异；TCBPA暴露组蝌蚪体内f2、f10和serpina基因的转录水平与TCBPA浓度(1.06～2.92 mg·L-1)呈“倒U型”关系，1.06 mg·L-1和1.49 mg·L-1的TCBPA显著促进蝌蚪体内f2基因的转录水平，1.49 mg·L-1的TCBPA显著促进蝌蚪体内f10和serpina的转录水平。

图4 TBBPA和TCBPA暴露48 h导致的非洲爪蛙蝌蚪心脏和尾部凝血现象注：(a)和(d)为对照；(b)和(e)为TBBPA暴露组；(c)和(f)为TCBPA暴露组。Fig. 4 Coagulation phenomenon in hearts and tails of Xenopus laevis tadpoles following 48 h-exposure to TBBPA and TCBPANote: (a) and (d) are control group; (b) and (e) are TBBPA group; (c) and (f) are TCBPA group.

图5 TBBPA(a)和TCBPA(b)对非洲爪蛙体内凝血因子转录的影响注：*P<0.05，与对照组相比。Fig. 5 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on coagulation gene in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

3 讨论(Discussion)

本研究结果表明，TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50分别为4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1。根据国家关于危险化学品鱼类急性毒性分类准则，TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙的毒性均为中等毒性[24]。Song等[25]的研究表明，TBBPA和TCBPA对斑马鱼的LC50分别为0.75 mg·L-1和1.24 mg·L-1，毒性分别为高毒和中毒；Hallgren等[15]报道了TBBPA对大鼠的半数致死剂量(LD50)为10 g·kg-1，毒性为微毒。总体来看，TBBPA对非洲爪蛙的毒性与水生生物斑马鱼类似，而远高于对哺乳动物的毒性。另外，研究发现TBBPA和TCBPA均导致蝌蚪心脏和尾部产生凝血现象，其作用机制还有待于进一步研究。

TBBPA和TCBPA显著上调非洲爪蛙体内氧化应激相关基因gst和trx的转录水平，呈线性剂量-效应关系，TBBPA和TCBPA对蝌蚪体内gr基因转录水平的影响呈“升高-平台期-升高”的趋势，并在TBBPA与TCBPA的最高浓度暴露组表现出显著性差异。gst、trx和gr基因的转录水平与氧化应激效应呈正相关。对比TBBPA与TCBPA相似浓度暴露组(如1.12 mg·L-1TBBPA暴露组与1.06 mg·L-1TCBPA暴露组)蝌蚪体内gst、trx和gr的转录水平后发现，TBBPA暴露组蝌蚪体内gst、trx和gr基因的相对表达量均与TCBPA暴露组类似。TCBPA暴露组蝌蚪体内cat和gpx基因相对表达量的变化趋势与TBBPA相同，呈先升高后降低的倒“U”型趋势。综上所述，TBBPA和TCBPA诱导非洲爪蛙蝌蚪产生氧化应激效应，二者效应相当。结合本实验室之前关于双酚A替代品与双酚A对非洲爪蛙毒性的研究，发现无论是BPA及BPA替代品(BPF和BPAF)还是BPA的衍生物(TBBPA和TCBPA)对非洲爪蛙几个经典氧化应激标记基因的转录水平的影响都十分显著，尤其对gst基因的影响，均呈良好的线性剂量-效应关系。

TBBPA与TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪体内热休克蛋白表达的影响表明，TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙体内hsp27基因的转录水平无显著性影响，1.12 mg·L-1TBBPA暴露组蝌蚪体内的hsp70与hsp90转录水平被显著上调，1.06 mg·L-1TCBPA暴露组蝌蚪体内hsp90的转录水平被显著上调，TBBPA和TCBPA对蝌蚪体内hsp70和hsp90的转录水平的影响整体均呈先升高后降低的“倒U型”。总体来看，TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙体内热休克蛋白的影响不大，只有个别浓度会引起hsp70和hsp90基因的微弱表达。结合本实验室之前关于双酚A替代品与双酚A对非洲爪蛙毒性的研究，发现BPA、BPA替代品和BPA的衍生物对热休克蛋白相关基因转录水平的影响均不显著。

综上所述，TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的毒性相近均为中毒，与对水生生物斑马鱼的毒性类似，远高于对哺乳动物的毒性；TBBPA和TCBPA对非洲爪蛙蝌蚪的氧化应激效应也接近，但不引起热休克蛋白转录的变化。