DNA免疫技术制备H10亚型禽流感病毒HA蛋白单因子血清的研究

高鑫鑫，郭晶，薛睿，赵聪慧，李旭勇

(聊城大学农学院，山东聊城 252000)

A型流感病毒为单股负链 RNA 病毒，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)不同，可将流感病毒分为不同的亚型(H1～H18和N1～N11)。禽类作为流感病毒的混合器，除了从蝙蝠体内分离的H17N10和H18N11两种新型流感病毒[1-2]，其他所有亚型的流感病毒均可在禽类中分离得到。2013年我国江西省出现了全球首例人感染H10N8亚型流感病毒事件[3]，研究表明引起人感染的H10N8流感病毒(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)为一株三源重组病毒，HA基因来自H10N3病毒，NA基因来自H10N8病毒，6个内部基因来自H9N2病毒。同样是在江西省，Ma等[4]在2013-2014年的活禽市场的鸡体内共分离得到124株H10N8和H10N6禽流感病毒(Avian influenza viruses, AIVs)，遗传演化分析表明H10N8 AIVs与致死的人源流感病毒(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)高度相似，证明家禽市场中鸡体内的流感病毒可能是人源病毒株的来源。Deng等[5]对2009-2013年在活禽市场分离出的8株H10N8 AIVs的研究表明，该亚型病毒对家禽无致病力，但可同时结合人源受体(α2, 6-SA)和禽源受体(α2, 3-SA)，且有4株病毒可引起小鼠体重下降约12.7%～22.5%。正是因为被感染动物的临床症状较温和，H10亚型AIVs常被人们所忽视，对其研究较少。为了有效监测并消灭H10亚型AIVs，保障生物安全和公共健康，建立H10 AIVs的快速检测方法具有重要的公共卫生学意义。

流感病毒亚型众多，对不同亚型流感病毒的快速检测一直是研究的热点。流感病毒检测技术有酶联免疫吸附法、荧光定量PCR、普通PCR、血凝试验和血凝抑制试验等。由于血凝抑制试验灵敏度高、特异性强、易于操作、价格低廉等特点，常作为流感病毒鉴定和检测的首选试验技术。目前，国内用于H10亚型AIVs鉴定的抗体大多是全病毒制备的血清，由于其含有较多的抗体成分和非特异性物质，进行流感病毒亚型鉴定时会出现交叉反应，造成假阳性，影响结果的准确性，为流感病毒亚型的鉴定带来干扰。基于DNA免疫技术的单因子血清是将流感病毒某一种或某几种蛋白克隆到真核表达载体后免疫动物而获得单因子血清,本研究将H10N8 AIVs的HA基因经鸡偏嗜密码子优化后克隆至真核表达载体pCAGGs，免疫6周龄的SPF鸡，从而获得针对H10亚型血凝素的单因子血清，为H10亚型AIVs的快速鉴定和病毒抗原性精准分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞、毒株和实验动物 根据GenBank中的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)(KJ406543.1)HA基因序列进行鸡偏嗜密码子优化后[6]，目的基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。感受态细胞购自北京全式金生物有限公司；pCAGGs载体由聊城大学农学院畜禽疫病防控技术创新团队保存；293T细胞购自中国科学院细胞库。SPF鸡购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I和XhoI均购自New England Biolabs公司。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒以及纯化试剂盒购自OMEGA公司。脂质体Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司。DMEM和胎牛血清均购自GIBCO公司。细胞裂解液购自Thermo Scientific公司，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)购自上海碧云天生物技术有限公司。FITC标记的兔抗鸡荧光抗体购自Thermo Scientific公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡抗体购自KPL公司。

1.3 表达质粒的构建及鉴定 用限制性内切酶EcoR I和XhoI分别对公司合成的目的基因、空载体质粒pCAGGs进行双酶切处理，用T4连接酶将载体和目的基因连接后转化到感受态细胞中，挑取阳性菌落、扩大培养、提取质粒后，用限制性内切酶EcoR I和XhoI双酶切获得目的基因并测序。测序结果正确，将阳性质粒命名为pCAGGs-H10，转化至感受态细胞扩大培养，大量制备重组质粒。

1.4 H10亚型禽流感病毒HA蛋白单因子血清的制备 取6只6周龄SPF鸡，将已鉴定的表达质粒pCAGGs-H10以每次200 μg/只的剂量对其肌肉注射，该区域进行电刺激，加强鸡的应激反应。一免后第30天以相同剂量进行第二次免疫，二免后第30天以相同剂量进行第三次免疫，三免后的第10天心脏采血，分离血清，制备单因子血清。

1.5 H10N8 AIVs 血凝素蛋白与单因子血清的相互作用

1.5.1 间接免疫荧光试验鉴定单因子血清 将表达质粒pCAGGs-H10转染至293T细胞，转染48 h后固定细胞，用单因子血清作为一抗孵育后，加入带有FITC标记的兔抗鸡的二抗，放于荧光显微镜下观察目的蛋白的表达。

1.5.2 western blot检测单因子血清 表达质粒pCAGGs-H10转染至293T细胞，48 h后离心收集细胞，根据细胞数量加入适量的细胞裂解液，反复吹散细胞，在4 ℃孵育30 min，加入等量的2×蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min。SDS-PAGE跑胶、转膜后，用脱脂乳封闭膜，PBST洗膜后用H10单因子血清做为一抗孵育，PBST洗膜后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡二抗孵育，Odyssey仪器扫描，鉴定单因子血清效果。

1.6 H10亚型单因子血清的效价评估及特异性试验

1.6.1 遗传演化分析 在NCBI的流感数据库中下载2012-2015年H10亚型AIVs的HA序列后，与A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的HA序列与进行遗传演化分析。

1.6.2 血凝抑制试验 以实验室分离的流感病毒A/Duck/Shandong/203/2017 (H1N1)、A/Chicken/Shandong/10/2018 (H3N2)、A/Chicken/Shandong/423/2016 (H4N6)、A/ Chicken /Jiangxi/683/2016(H5N1)、A/Chicken/Shandong/1831/2016 (H6N2)、A/Goose/Shandong/3/2019 (H9N2)、A/Chicken/Shandong/146/2018 (H10N6)、A/Chicken/Shandong/23/2017 (H10N8)和新城疫病毒NDV/Chicken/Shandong/2008/2017为抗原，与制备的H10单因子血清和实验室保存的H5、H9单因子血清进行血凝抑制试验，同时以PBS作为对照，检验H10亚型单因子血清的特异性和交叉反应原性。

2 结果与分析

2.1 表达质粒的构建及酶切鉴定 将表达质粒pCAGGs-H10用限制性内切酶EcoR I+XhoI于37 ℃酶切2 h后，得到1700 bp的HA基因片段(图1)，将该片段收回测序，测序结果正确，表明表达质粒构建成功。

M：DNA分子质量标准；1：表达质粒pCAGGs-H10；2：表达质粒pCAGGs-H10的双酶切片段M: DL5000 DNA Marker; 1: Recombinant plasmid pCAGGs-H10;2:Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pCAGGs-H10

2.2 HA蛋白与单因子血清的相互作用

2.2.1 间接免疫荧光试验结果 荧光显微镜检测发现，转染pCAGGs-H10的293T细胞产生特异性绿色荧光，转染空载体的293T细胞检测不到荧光(图2)，表明真核重组表达质粒能够表达H10N8 AIVs的血凝素蛋白，并且该目的蛋白与制备的单因子血清相互作用。

2.2.2 western blot检测结果 检测发现血凝素蛋白在75 ku处表达(图3)，该蛋白与单因子血清相互作用，表明单因子血清制备成功。

A：表达质粒pCAGGs-H10转染至293T细胞；B：空载体pCAGGs转染至293T细胞A:Transfected pCAGGs-H10 into 293T;B:Transfected pCAGGs into 293T

1：表达质粒pCAGGs-H10转染至293T细胞；2：空载体pCAGGs转染至293T细胞1: Transfected pCAGGs-H10 into 293T;2:Transfected pCAGGs into 293T

2.3 H10亚型HA单因子血清的特异性试验

2.3.1 遗传演化分析 H10亚型AIVs的HA基因主要分为欧亚谱系和北美谱系。应用MAGE.7软件对克隆的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8) 的HA序列进行比对，绘制基因进化树。图4结果显示，克隆的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8) 的HA序列属于欧亚谱系，并且该克隆株的HA序列与我国流行株高度同源。

图4 HA基因的进化树分析

2.3.2 血凝抑制试验结果 实验室分离的多株流感病毒和新城疫病毒NDV/Chicken/Shandong/2008/2017作为抗原，与制备的H10单因子血清进行血凝抑制试验，结果只有A/Chicken/Shandong/146/2018 (H10N6)、A/Chicken/Shandong/23/2017 (H10N8)与H10单因子血清发生血凝抑制反应，抗体效价分别为256、128，表明制备的H10亚型单因子血清与其他亚型AIVs无交叉反应，针对目前我国国内流行的H10亚型AIVs具有良好的特异性和敏感性。

3 讨论与结论

近年来，禽流感的流行与暴发给养禽业的发展和公共卫生安全造成了严重危害。2013年我国江西省出现了H10N8亚型流感病毒感染人并造成死亡的事件，使得该亚型流感病毒引起各界广泛关注。H10N8亚型AIVs最早由Zhang等[7]分离于2007年我国洞庭湖水域，该病毒对哺乳动物小鼠无致病力，但在小鼠体内传代后获得致病力，并且PB2-E627K、M1-M192V等多个氨基酸位点突变。研究表明，H10亚型AIVs除了鸡、鸭等家禽中，在野生水禽也能检出[7-9]，提示我们H10亚型低致病性AIVs在自然界中分布较广。野鸟携带的病毒可能与家禽携带的病毒同时感染同一宿主，增大了不同毒株间发生基因重排乃至产生危害性更大的重组病毒的可能性[8]，正如感染人并致死的A/Jiangxi-Donghu/346/2013(H10N8) 三源重组病毒株。因此，应该加强对H10亚型AIVs的监测力度，预警该亚型病毒在自然界中的持续进化将会对生物安全和公共健康造成持续的潜在威胁。

表1 H10单因子血清与其他亚型AIVs和新城疫病毒抗原的血凝抑制试验

本试验将经鸡偏嗜密码子优化后的A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)流感病毒的HA基因克隆到pCAGGs载体，免疫SPF鸡后获得单因子血清。间接荧光免疫试验和western blot试验结果表明，制备的H10亚型单因子血清可与HA蛋白相互作用，并且单因子血清的特异性试验结果显示该单因子血清只能与H10亚型的HA蛋白相互作用，与其他亚型AIVs以及其他种类病毒无相互作用，从而获得特异性强、敏感性好、无交叉反应的H10亚型单因子血清。这与传统通过免疫灭活全病毒或直接免疫活病毒以获取抗某种亚型血清的方式相比更具安全性，并且避免了使用全病毒免疫的血清进行HI试验时，NA抗体会非特异性地干扰HA，从而导致非特异性血凝抑制现象的问题。目前，有关H10N8的遗传进化分析的报道较少，不断检测分析H10亚型AIV在自然界中的分布及进化情况在H10亚型AIV于自然界中分布较广、重组病毒株能够感染人并致死的背景下，该H10亚型单因子血清的成功制备为H10亚型AIVs的检测提供了有力支持。