高效液相色谱法测定麻杏石甘颗粒中盐酸麻黄碱含量

米彦飞，侯丽丽，武晋孝，郭禹

(山西省畜牧产品质量安全检验监测中心，太原 030027)

麻杏石甘颗粒收载于《兽药质量标准》2017年版中药卷，处方由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草组成，具有清热化痰、止咳平喘功能，主治肺热咳喘[1]，处方中麻黄为君药。麻黄为麻黄科植物草麻黄(Esinica)、木贼麻黄(E.equisetina)或中麻黄(E.intemedia)的干燥草质茎[2]。盐酸麻黄碱是中药麻黄的主要成分，具有解热、抗过敏、兴奋中枢神经与松弛支气管平滑肌等多种有效药理作用[3]，属于国家规定严格管控的药物[4]，使用不当可产生多种毒副作用[5]。盐酸麻黄碱有多种检测方法，如分光光度法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法、电位测定法等[6]，但未有专门针对麻杏石甘颗粒中盐酸麻黄碱的定量检测方法。《兽药质量标准》中麻杏石甘颗粒项下仅有薄层色谱鉴别标准，未有盐酸麻黄碱的含量测定项。为进一步提高麻杏石甘颗粒质量标准，保证临床效果，减少毒副作用，本试验对高效液相色谱测定麻杏石甘颗粒中盐酸麻黄碱含量方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 Agilent1260高效液相色谱系统，紫外检测器/G1314，原装色谱工作站，四元梯度泵/G1311C，自动进样器/G1329B，柱温箱/G1316A，购于安捷伦科技有限公司。TB-215D型电子天平，购于美国丹佛公司。

1.2 材料与试剂 盐酸麻黄碱对照品，批号171241-201508，纯度99.8%，购自中国兽医药品监察所。麻杏石甘颗粒(批号201805001)，100 g/袋，保定冀中药业有限公司制样。阴性样(缺麻黄的麻杏石甘颗粒)(批号201805001)，100 g/袋，保定冀中药业有限公司制样。乙腈为色谱级，磷酸、三乙胺、盐酸为分析纯，水为超纯水。

1.3 色谱条件 色谱柱：Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97，V/V)；紫外检测器：检测波长207 nm；流速：1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液 准确称取盐酸麻黄碱对照品适量，加流动相溶液稀释，制得120 μg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液，摇匀。将所得溶液用流动相按比例稀释，制得60、40、20、10、5 μg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液，摇匀，0.22 μm滤膜滤过。

1.4.2 供试品溶液 准确称取麻杏石甘颗粒样品1.0 g(精确至0.01 g)，置50 mL量瓶中，加水3 mL微温使溶解，加浓氨溶液1 mL，加三氯甲烷定容至刻度，精密称重，超声20 min，放冷，用三氯甲烷补足减失的重量，振摇，过滤，取续滤液25 mL，加入5%盐酸乙醇溶液4 mL，水浴蒸干，残渣加流动相溶液溶解，定容至25 mL容量瓶，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，即得。

1.4.3 阴性样品溶液 准确称取不含麻黄的麻杏石甘颗粒阴性样品1.0 g(精确至0.01 g)，按1.3.2项方法制备，即得。

1.4.4 阳性添加样品溶液 准确称取不含麻黄的麻杏石甘颗粒阴性样品1.0 g(精确至0.01 g)，精密加入盐酸麻黄碱对照品，按1.4.2项方法制备，即得。重复制备6份。

2 结果与分析

2.1 色谱图与阴性干扰试验 精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，盐酸麻黄碱与相邻峰达到基线分离，分离度达到4.22，盐酸麻黄碱峰保留时间为19.5 min，理论板数为22381，峰面积为183.1，峰宽0.30 min。阴性样品在与对照品色谱峰相应位置上，无吸收峰。综上所述，本方法色谱图满足试验要求，前处理方法可有效去除制剂中干扰杂质(图1)。

图1 HPLC色谱图(A.对照品；B.供试品；C.阴性样品)

2.2 溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL，记录色谱图和盐酸麻黄碱峰面积。结果显示， 12 h内供试品峰面积相对标准偏差RSD为1.60%，样品溶液在12 h内稳定(表1)。

表1 溶液稳定性试验数据表

2.3 线性关系试验 分别取1.4.1项60、40、20、10、5 μg/mL对照品溶液，进样10 μL。以峰面积为纵坐标，盐酸麻黄碱含量(X-mg/mL)为横坐标作线性回归，回归方程为：y=23.659x+ 8.0002，R2= 0.9999。结果表明，盐酸麻黄碱在5～60 μg/mL范围内，峰面积与盐酸麻黄碱含量呈良好的线性关系(图2)。

图2 盐酸麻黄碱线性关系图

2.4 精密度试验 取20 μg/mL浓度对照品溶液，进样10 μL，连续进样6次。以峰面积计算，盐酸麻黄碱相对标准偏差RSD为0.70%，表明精密度良好，符合检测要求(表2)。

表2 精密度试验数据表

2.5 重复性试验 对同一批供试品按1.4.2项方法，重复配制6份供试品溶液，注入色谱仪，进样10 μL。结果表明，6份样品相对标准偏差RSD为1.20%，重复性符合检测要求(表3)。

表3 重复性试验数据表

2.6 加样回收率试验 分别取1.4.4项6份阳性添加样品溶液注入色谱仪，各进样10 μL，记录色谱图，计算加样回收率。回收率=加对照品后测得的含量/实际所加对照品量×100%。结果表明，盐酸麻黄碱的平均回收率为96.62%(n=6)，RSD为1.30%，回收率试验符合检测要求(表4)。

表4 加样回收率试验结果

2.7 样品含量测定 为了充分考虑不同批次产品的含量差异，以制定出切实可行的该制剂含量标准限度。使用本方法对市售麻杏石甘颗粒、新注册麻杏石甘颗粒和自制样(保定冀中药业有限公司制样)盐酸麻黄碱含量进行测定。结果显示(表5)，样品中盐酸麻黄碱最低含量为0.31 mg/g，最高含量为1.07 mg/g，平均含量为0.58 mg/g。根据13批样品检测结果，综合考虑确保安全、有效、质量可控，建议本品的含量限度制定为：本制剂每l g含麻黄以盐酸麻黄碱(C10H15NO·HCl)计，不得少于0.35 mg。

3 讨论与结论

3.1 前处理方法的选择 盐酸麻黄碱的提取方法主要分为两类，第一类方法是考虑到盐酸麻黄碱可溶于水、乙醇的特点，直接使用超纯水超声提取[7-8]、流动相超声提取[9]、醇提取[10]等，此类方法简单快捷，缺点是干扰杂质较多。第二类方法是在第一类方法基础上增加有机相萃取操作，如乙醚萃取[11]、二氯甲烷萃取[12]等。本试验从提高回收率、减少杂质干扰、方法简单可操作性三个方面对前处理方法进行考察。由于麻杏石甘颗粒制剂成分复杂，使用第一类方法色谱图上杂质峰过多，无法满足检测要求，增加萃取步骤后则可显著减少杂质峰。综合对比，本试验前处理方法为最优选择。

3.2 流动相的选择 高效液相色谱法测定盐酸麻黄碱含量的流动相主要有甲醇-磷酸系列[13]、乙腈-磷酸系列[14]以及甲醇-乙腈-磷酸系列[15]等。由于甲醇在210 nm的末端波长处有少量紫外吸收，使用乙腈替换甲醇，基线更加平稳[9,16]，因此，主要考察乙腈-磷酸系列流动相。试验发现乙腈和0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)比例在1∶99至5∶95范围内，均能实现盐酸麻黄碱的良好分离。

3.3 色谱柱的选择 《中国药典》2010 年版(一部)和《中国兽药典》 2015 年版(二部)麻黄项下对盐酸麻黄碱的测定中均使用了极性乙醚连接苯基键合硅胶柱，该色谱柱价格较贵，使用率不高，未采纳。本实验分别采用Syncroni AQC18(5 μm，4.6×150 mm)、Agilent XDB C18(5 μm，4.6×250 mm)和Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)三种不同的色谱柱进行测定，均能有效分离目标成分。经峰形、峰拖尾、分离度、稳定性等各方面比较后，Thermo scientific BDS C18(5 μm，4.6×250 mm)色谱柱效果最好。

本研究所建立高效液相色谱法测定麻杏石甘颗粒中盐酸麻黄碱含量的方法，经过方法学验证，简便、准确度高、重复性好、耐用性强，适用于麻杏石甘颗粒中盐酸麻黄碱含量的测定，为麻杏石甘颗粒质量控制提供了科学依据。