悬灸对哮喘大鼠转录因子ROR-γt、GATA-3及T-bet的影响❋

张 伟

(威海市中医院，山东 威海 264200)

研究显示，CD4+T细胞分化失衡是导致哮喘气道炎症的重要因素，其中Th1、Th2引起的免疫失衡理论是比较经典的理论。在Th0向Thl、Th2分化过程中，转录因子T-bet和GATA-3是重要因子，其中T-bet是2000年首次报道的一种新的转录因子[1]，仅在胸腺细胞和Thl细胞中选择性表达，GATA-3为Th分化所必需且仅在Th2中表达[2]。Th17[3]是2005年新发现的Th细胞亚群，它以分泌IL-17为主，并介导以中性粒细胞升高为主的哮喘， ROR-γt[4]是中性粒细胞哮喘过程中特异性转录因子。

据文献分析[5-6]，通过对各项肺功能指标如最大通气量、静息通气量、补呼气容积、深吸气量、肺活量、潮气量等检测得出结论，艾灸是文献中治疗哮喘出现次数较多、出现频率较高的技术手段。哮喘属于灸法独立干预的优势病种之一。据实验研究显示[7-9]，悬灸疗法不仅改善哮喘大鼠行为学评分和病理状态，而且提高血清中的IFN-γ/IL-4，进一步改善Th1/Th2，减少气道内炎症的反应。

本实验拟研究ROR-γt、GATA-3、T-bet转录因子与中性粒细胞哮喘、嗜酸细胞哮喘的特异相关性，并探讨悬灸对2种哮喘的干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验分组

75只SPF级SD雄性大鼠，体质量180 g～210 g，购自斯莱克景达动物有限公司(合格证编号43004700026841)，包括A组(正常组)、B组(中性粒模型组)、C组(中性粒悬灸组)、D组(嗜酸粒模型组)、E组(嗜酸粒悬灸组)，每组各15只。

1.2 主要试剂和仪器

10%卵白蛋白(OVA,Sigma)，T-bet一抗、GATA-3一抗、ROR-γt一抗、β-actin 抗体、二抗羊抗鼠(均由中杉金桥生物技术有限公司提供)； Real time PCR mastermix、反转录试剂盒(由TransGenBiotech提供)；PCR引物(上海生工)，Trizol(Invitrogen公司)，脂多糖(Sigma)。超声雾化器(鱼跃医疗)，凝胶成像分析系统、分光光度仪、高速冷冻离心机(均购自Thermo Fisher Scientific公司)，Real time PCR仪(Applied biosystems)。

1.3 造模方法

中性粒细胞哮喘[10]：致敏：第1、8天先腹腔注射麻醉(3%戊巴比妥钠、30 mg/kg)，竖颈，开放气道，用移液器将脂多糖滴入鼻孔至气道(2 mg/kg)，并腹腔注射10%OVA(100 mg/kg)；激发：2周后雾化吸入1%OVA引发哮喘，中等雾量，每天20 min，持续雾化2周。

嗜酸细胞哮喘[11]：致敏：第1、8天腹腔注射10%OVA(100 mg/kg)；激发：2周后雾化吸入1%OVA引发哮喘，中等雾量，20 min/d，持续雾化2周。正常组均使用灭菌注射用水代替，步骤同前。

1.4 治疗方法

参照《实验针灸学》[12]取穴。膻中：两乳连线中点，平第4、5肋间；肺俞：T3胸椎下两旁；脾俞：T11胸椎下两旁；肾俞：S2腰椎下两旁。艾灸方法：将艾条(长12 cm、直径1 cm)于腧穴上方约2 cm处，先做回旋灸、雀啄灸、循经往返灸等以温通经脉、激发经气，时长约5 min，然后于穴位处固定施行温和灸。开始介入治疗时间为实验的第15天，每日1次，每次40 min，每次于雾化引喘前30 min结束，共14次。

1.5 样品采集及指标检测

1.5.1 大鼠肺组织中ROR-γt、T-bet、GATA-3蛋白测定(免疫组织化学法) 取右肺下叶石蜡包埋，切片脱蜡，一抗孵育、显色，二抗孵育，复染封片。每个样本于高倍视野(10×40)下随机选取20个互不重叠视野，测定平均吸光度值。采用Image-Pro Plus分析软件进行分析。

1.5.2 肺组织中ROR-γtmRNA、T-betmRNA、GATA-3mRNA的表达测定(RT-PCR技术) 表1显示，取右肺下叶组织，抽提总RNA，逆转录cDNA。PCR反应，条件：93 ℃，30 s(93 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s)×40个循环，电泳。根据RQ=2-△△Ct算mRNA相对表达量。

表1 各转录因子引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

图1表2示，经免疫组化法及RT-PCR法检测，与正常组比较，中性粒模型组、嗜酸粒模型组各因子蛋白及mRNA表达皆有非常显著性升高(P<0.01)。与嗜酸粒模型组比较，中性粒模型组ROR-γt蛋白及mRNA表达显著升高(P<0.01)，而GATA-3、T-bet蛋白及mRNA表达又显著降低(P<0.01)。经悬灸治疗后，中性粒悬灸组与模型组比较、嗜酸粒悬灸组与模型组比较，各因子的蛋白及mRNA表达均有非常显著性降低(P<0.01)。由上得出，ROR-γt因子与中性粒细胞哮喘有高度的相关性，而因子GATA-3、T-bet与嗜酸细胞哮喘的发作有密切相关性；悬灸可以通过对靶点ROR-γt、GATA-3、T-bet的干预，从而减轻气道中性粒细胞和嗜酸细胞的含量。

表2 各组肺组织中ROR-γt、GATA-3、T-bet蛋白及mRNA表达比较

注：与A组比较:▲▲P<0.01；与B组比较:●●P<0.01；与C组比较:■■P<0.01；与D组比较:□□P<0.01

图1 各组肺组织中ROR-γt、GATA-3、T-bet表达免疫组化染色图只鼠/组)

3 讨论

以Th2介导的嗜酸粒细胞增多引发哮喘的理论是经典的免疫学理论。但后来发现，嗜酸粒细胞增多并不能解释所有的哮喘呼吸道炎性反应，Th17细胞及其介导的中性粒细胞性炎症与哮喘也密切相关。核孤儿受体-γt(ROR-γt)[13-14]不仅诱导初始T细胞向Th17分化，而且在分化成熟的Th17细胞内特异性高表达。当ROR-γt缺陷时，组织浸润和募集炎症细胞能力降低，炎症性疾病症状减轻[15]；此外，GATA-3、T-bet是Th细胞分化调控的关键转录因子。GATA-3是Th2高表达的特异因子，在Th0向Th2分化过程中，GATA-3基因自身活化并促使正在分化或已分化的Th向Th2分化。干扰素γ(IFN-γ)与T-bet密切相关[16]。IFN-γ与受体结合后，激活T-bet基因，激发Th细胞向Thl方向分化；而T-bet也可反向促进IFN-γ的激活，使IFN-γ的等位基因位点变异。所以，通过T-bet对IFN-γ基因转录的直接调控，可能触发Th细胞向Thl方向分化。由此可见，ROR-γt、GATA-3和T-bet可能是Th17、Th2、Th1特异性转录因子，对于Th细胞的分化起到至关重要的作用。通过干预ROR-γt、GATA-3和T-bet的表达，对调控Th的分化、控制哮喘气道炎症可能起到关键作用。

在本实验中，免疫组化法、RT-PCR法测得的ROR-γt、GATA-3和T-bet表达量说明2种哮喘模型中上述3种转录因子皆有高表达，而中性粒模型组以高表达ROR-γt为主，而嗜酸粒模型组以高表达GATA-3和T-bet为主；经悬灸肺俞、脾俞、肾俞、膻中后，中性粒悬灸组与模型组比较、嗜酸粒悬灸组与模型组比较，3种转录因子皆有非常显著性降低。

综上说明，Th细胞在分化过程中有特定转录因子参与调控及高表达，其中ROR-γt转录因子的高表达主要引发中性粒细胞哮喘，而GATA-3、T-bet的高表达则引起嗜酸粒细胞哮喘的发生；通过悬灸治疗可以调节ROR-γt、GATA-3、T-bet的表达，从而降低哮喘的气道炎症反应。