响应面法优化中药降脂复方多糖提取工艺及抗氧化研究

王娅玲 陶然 梁峰源 李佳怿 于佩琳 韩凯月 高世杰

摘      要：通过响应面法优化中药降脂复方中总多糖最佳提取工艺，计算了最佳提取条件下总多糖得率，通过体外抗氧化实验评价其药理作用。根据单因素实验结果，利用超声法优化总多糖的提取工艺，通过自由基清除率分析其抗氧化能力。结果为向1 g中药复方粉末中加入30 mL蒸馏水，水浴超声50 min，酸碱度为9的情况下总多糖得率最高，自由基清除率为84.93%。

关  键  词：高血脂;总多糖含量;响应面优化;体外抗氧化

中图分类号：TQ 041      文献标识码： A      文章编号： 1671-0460（2020）03-0555-04

Optimization of Lipid-lowering Compound Polysaccharide Extraction

Process by Response Surface Method and Its Antioxidant Ability

WANG Ya-ling， TAO Ran， LIANG Feng-yuan， LI Jia-yi， YU Pei-lin， HAN Kai-yue， GAO Shi-jie

（Shandong University of traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，China）

Abstract： By optimizing the optimal extraction process of total polysaccharide in the refaton-reducing complex of Traditional Chinese medicine by the response surface method， the total polysaccharide yield rate under the optimal extraction condition was calculated， and its pharmacological effect was evaluated by in vitro antioxidant experiments. According to the results of single-factor experiments， the extraction process of total polysaccharide was optimized by ultrasonic method， and the antioxidant capacity of free radical removal was analyzed by free radical removal rate. Results For the addition of 30 mL distilled water to 1g Chinese medicine compound powder， water bath ultrasound 50 min， acidity and alkalinity of 9 cases， the total polysaccharide yield is the highest， free radical removal rate of 84.93%.

Key words： high blood fat; total polysaccharide content; response surface optimization; in vitro antioxidant

研究表明，自由基過量易损伤细胞，对人体有潜在危害，因此研究抗氧化活性减少自由基的产生或加速清除研究，日益成为市场最重要的功能性诉求之一^[1]，此方为王集会教授根据多年实践经验总结出的新配方，多糖为方中主要有效成分之一，能清除多余自由基、促进脂质代谢^[2]、提高免疫力。

该复方包括荷叶、薏苡仁、人参、白术、当归、大黄、山楂等中药，涂宗财^[3]等研究表明荷叶多糖具有较好的抗氧化活性，超声水提法与传统热水浸提法相比多糖得率更高;李珊珊^[4]等研究表明人参多糖能够调节人体代谢、增强人体免疫力，临床应用效果显著;石娜^[5]等通过小鼠实验表明白术多糖可以清除人体自由基，具有良好的抗氧化活性。目前人们越来越热衷于复方配伍的研究，这几味中药联合使用可增强药效^[6]，减轻毒副作用。

根據单因素实验结果，以最终测得总多糖得率为指标，设计三因素三水平响应面实验确定最佳提取条件，依据各个因素的相互作用与显著性，测定降脂复方中总多糖对体内多余的自由基清除率，初步评价其抗氧化能力，对降血脂新药和保健品的开发提供一定的理论依据。

1  实验部分

1.1  药品

此方包括陈皮、荷叶、薏苡仁、灵芝等20味中药，经实验室自制得到干燥粉末。

1.2  试剂

苯酚、浓硫酸、无水葡萄糖等。

1.3  仪器

紫外可见分光光度计;冷冻离心机^[7];移液枪;超声清洁仪;真空抽滤泵等。

2  实验方法

2.1  响应面实验设计

2.1.1  标准曲线的绘制

参照文献方法采用紫外可见分光光度法测定恒重葡萄糖的吸光度， 所得回归方程为：

y = 0.502 9x + 0.007 5，R² = 0.998 3

表明该中药复方总多糖含量测定线性良好^[8]，实验测定结果准确。

2.1.2  中药降脂复方中总多糖含量测定

精确称取1.0 g中药纤体粉末，调至料液比为1∶30、pH=9，保持40 ℃不变超声50 min，离心，抽滤，定容至100 mL， 吸取2 mL待测溶液，按“2.1.1”方法测定待测溶液总多糖含量^[9]。

2.1.3  单因素实验

见表1，准确称取1.0 g粉末，提取制备待测溶液，分析不同条件下超声时间（A）、料液比（B）、pH值（C）三个因素对降脂复方中总多糖提取的影响^[10]。

2.1.4  响应面实验

分析单因素实验结果，考察三个影响因素及其交互作用对中药复方中总多糖提取的影响，确定超声辅助法提取的最佳工艺，获取所需实验数据^[11]。

2.2  体外抗氧化实验

见表2，配制抗氧化实验标准DPPH溶液，于520 nm波长下测定不同待测溶液的吸光度，结合阳性对照抗坏血酸，分析降脂复方中总多糖对DPPH自由基的清除能力。

3  实验结果

3.1  响应面优化实验结果

分析单因素实验，设计响应面实验，对三个因素进行分析，建立参数回归模型进行方差分析，得到回归方程：Y=53.73+0.063A+0.96B+1.67C+0.30AB+0.47AC-0.35BC-2.70A²-3.05B²-0.43C²，方差分析结果见表3。

见表4，A（超声时间）、B（料液比）对总多糖含量测定影响不显著，C（pH值）对总多糖含量测定影响显著;二次项中，P值均小于0.05，A²、B²对结果影响显著，C²对复方中总多糖得率影响不明显^[12]， P值大于0.05;同时，方差分析结果表明，三个影响因素两两之间的交互作用对多糖测定作用较小^[13]。方差分析R²=0.870 0， R_adj²=0.703 0，表明拟合度较好，实验过程操作较为严谨，70.30%的实验结果受到影响，该回归模型可用于降脂复方总多糖提取工艺的分析与预测^[14]。

3.2  交互作用分析

响应面曲线开口朝下，说明多糖得率在0.2～0.6 mg·g^-1范围内存在最大值。

由图1可知，固定pH值不变，仅考虑料液比和超声时间的影响，二者都对多糖溶出有促进作用^[15]。曲面较陡，等高线稀疏^[16]， 其交互作用干扰较小。超声超过50 min后得率开始降低，可能原因为超声时间为50 min时，细胞壁被超声波破坏， 在超声辅助下多糖充分溶解，时间过长，多糖结构受到破坏，非多糖类成分溶出，干扰多糖的提取，使总多糖得率降低。

由图2可知，曲面较为平缓，等高线稀疏，表明pH值和料液比对多糖浸出影响不显著，其交互作用对响应值干扰也较小，多糖浸出率受pH值的影响大于料液比的影响。多糖含量受提取溶剂的影响较大，但提取溶剂过多，其他因素的干扰作用也加大，多糖溶出受到抑制;固定超声时间不变，仅考虑料液比和pH值的影响，在酸性条件下，pH的改变几乎对多糖含量测定没有影响，强碱性条件下，多糖结构破坏，使得率降低，pH=10时，多糖得率最高。

由图3可知，双曲面较平缓，等高线呈椭圆形，分布较为密集，表明pH值和超声时间对复方总多糖测定的影响弱于其交互作用，多糖浸出率受pH值的影响大于超声时间的影响，可能原因多糖被分解破坏，蛋白、黄酮等其他物质溶出。

3.3  体外抗氧化实验

DPPH自由基清除率为评价抗氧化能力的常见指标。人体许多疾病的发生与自由基关系密切，自由基氧化反应对人体细胞具有一定的损害作用。见图4，复方中多糖对DPPH自由基清除效果较好，在0.2～0.6 mg·mL^-1范围内，DPPH自由基清除率呈上升趋势，清除率与浓度呈正相关^[17]，抗氧化能力强于相同条件下的抗坏血酸，因此其抗氧化能力与稀释度成线性相关，实际应用中可适当增加浓度来提高药效。

4  结论

本实验在单因素的基础上，采用BoxBehnken法优化总多糖提取工艺，以料液比、超声时间、pH值为因素^[18]，并在最佳条件下进行体外抗氧化实验研究。通过响应面方差分析，研究各因素与响应值之间影响强弱并对其优化和评价。结合单因素实验确定为向1 g中药复方粉末中加入30 mL蒸馏水、水浴超声50 min、酸碱度为9的情况下，此时总多糖得率为5.405%。根据F值可知， 三个因素中pH值影响最大，提取溶剂的用量次之，超声时间影响最小。体外药理实验表明^[19]，降脂复方中DPPH自由基清除率为84.93%，具有显著的抗氧化活性，为开发高效降脂药物提供一定的实验基础。

研究表明植物多糖具有显著降低血脂含量的作用，可调節免疫代谢、保护心脑血管，在治疗高脂症方面应用前景广阔。中药降脂复方可调节脂质代谢紊乱^[20]、减少脂质的吸收，因其效果显著，用药安全，吸引越来越多的学者热衷于中药调节血脂的研究^[21]。复方中百合、山药、山楂、薏苡仁等中药既有药用价值，也有营养价值^[22]。在日常生活中，可以作为食物长期使用从而达到养生保健、降低血脂的作用^[23]， 促使中药食品化、现代化。

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