黄芩苷对糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响*

尹青桥，夏瑗瑜，陈杰，肖玲，王优，赵媛媛，叶刚，吴军

（武汉市第三医院 1.肾内科，2.内分泌科，湖北 武汉 430062）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是终末期肾衰竭的主要原因，也是糖尿病患者死亡的重要原因[1]。随着全球2 型糖尿病患病率的增加，需要进行连续肾脏替代疗法的患者数量也迅速增加[2]。目前，有关DN 治疗和发病机制的研究已有很多，但成效甚微。大多数研究表明DN 发病与机体的氧化应激反应（oxidative stress,OS）有关[3]，因此，对抗OS 损伤可能成为有效预防和治疗DN 的途径之一。抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）是机体抵抗OS 损伤的路径之一。核因子E2 相关因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2,Nrf2）作为ARE 的激活因子，可通过刺激各种抗氧化相关基因的表达在抵御OS 中发挥重要作用[4-5]。当机体出现OS 状态时，Nrf2 转入细胞核内与ARE 结合，启动抗氧化相关基因的表达，从而增强细胞抗OS 的能力。此外，OS 损伤是导致肾小管上皮细胞凋亡的重要机制。然而，有关Nrf2-ARE 信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用鲜有报道。

黄芩苷一种从中药中提取的黄酮苷类化合物[6]，具有清除氧自由基、抑菌消炎、降压、抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗氧化等的作用，被广泛用于治疗传染病和炎症性疾病[7-8]。此外，黄芩苷对肾脏也具有一定的保护作用。ZHANG 等[9]发现黄芩苷能改善铅中毒引起的小鼠肾脏氧化损伤。LIN 等[10]发现黄芩苷通过减轻氧化应激和肾缺血再灌注损伤改善肾功能。最值得关注的是，有研究还发现黄芩苷对治疗DN 有重要作用[11-13]。然而，黄芩苷治疗DN 的作用机制尚未完全阐明。因此，本研究旨在探讨黄芩苷对肾小管上皮细胞凋亡的影响及其在DN 治疗中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及仪器

C57BL/6 雄性小鼠（8周龄，20～22 g）购自武汉 大学动物实验中心[SYXK（鄂）2014-0013]，ARE 报告基因试剂盒、Dual-Glo®荧光素酶检测试剂盒、ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，丙二醛（Malondialdehyde,MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，Nrf2 抗体购自美国Santa Cruz 公司，细胞溶解缓冲液、BCA 蛋白分析试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，ECL 发光液购自美国Millipore 公司，Nrf2 激活剂NK-252 购自美国Med Chem Express 公司，血糖仪购自美国强生公司，链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）购自美国Sigma 公司，Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司，黄芩苷购自南京青泽医药科技开发有限公司，FACS Verse 流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson 公司。

1.2 DN 模型复制

30只C57BL/6 雄性小鼠随机分成空白对照组（对照组）、DN 模型组（DN 组）和黄芩苷干预组（干预组），每组10只。

小鼠禁食12 h 后，腹腔单次注射150 mg/kg STZ溶液（STZ 溶解在pH 4.5 的柠檬酸缓冲溶液中）；72 h 后于小鼠尾尖取血，并用血糖仪测量血糖，血糖＞ 16.17 mmol/L 且持续出现蛋白尿（尿白蛋白＞300 μg/24 h）的小鼠视为DN 模型复制成功。模型复制成功后每隔3 天对血糖和尿白蛋白进行复查。

对照组予同剂量柠檬酸缓冲溶液。干预组在模型复制成功后予黄芩苷（80 mg/kg）灌胃给药，1 次/d，持续10周。实验最后1 天用代谢笼收集各组小鼠24 h 尿液样本，并用ELISA 试剂盒（一步ELISA 法）测定尿白蛋白浓度。实验结束后，安乐死小鼠，取肾脏于-80℃冰箱保存备用。动物实验获得武汉市第三医院医学伦理委员会的批准。

1.3 肾小管病理学观察

取上述各组小鼠的肾组织并用4%多聚甲醛固定，行常规石蜡包埋、切片及HE 染色后，于普通光学显微镜下观察。

1.4 Western blotting 检测Nrf2 蛋白表达水平

取小鼠肾组织或肾小管上皮细胞，加入细胞溶解缓冲液后置于冰上孵育30 min。收集细胞裂解液经12 000 r/min 离心5 min 后，取上清液并用BCA 蛋白分析试剂盒检测蛋白浓度。取等量的蛋白样品（60 μg）进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。随后将蛋白转至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上并用5%脱脂奶粉封闭1 h。接着PVDF 与一抗（Nrf2抗体，1∶500）4℃孵育过夜；洗膜后加入二抗并于室温下孵育1 h。最后，洗膜3 次，ECL 发光液显色并扫描结果，利用Laser densitometer分析软件进行定量分析。β-actin 为内参。

1.5 ARE 报告基因活性检测

通过ARE 报告基因试剂盒检测ARE 的活性。将目标细胞接种在96 孔培养板上，当细胞融合率达80%时进行ARE 荧光素酶报告基因载体转染。24 h后收集细胞用于荧光素酶活性检测。依照Dual-Glo®荧光素酶检测试剂盒说明书操作，将20 μl 细胞裂解液和100 μl 荧光素酶测试试剂Ⅱ混合，采用VICTOR ×多标记检测仪检测细胞裂解物萤火虫荧光素酶的活力。随后，每孔加入100 μl Stop & Glo ® 试剂，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海肾荧光素酶反应，并检测其活力。萤火虫荧光素酶值/海肾荧光素酶值即为相对荧光素酶值。

1.6 细胞实验

1.6.1 肾小管上皮细胞的分离和培养 取小鼠肾脏，分离并剪碎肾皮质，过100 目筛收集肾小管节段，加入 0.25%胰蛋白酶并于37℃水浴下消化30 min。消化终止后离心、弃上清液，收集肾小管上皮细胞，在DMEM（含25 mmol/L 葡萄糖）中于37℃、5%二氧化碳CO2的饱和湿度条件下培养。DMEM 中含100 mg/L链霉素、100 u/L 青霉素和10%胎牛血清。待细胞融合度达80%～90%，消化后进行后续实验。

1.6.2 实验分组及处理方法 ①高糖组：细胞在含25 mmol/L 葡萄糖的高糖培养基中培养；②激活组：细胞在高糖组处理的基础上，用Nrf2 激活剂NK-252（20 μmol/ml）预处理肾小管上皮细胞24 h。③黄芩 苷组：细胞在高糖组处理的基础上，用黄芩苷（100 μmol/L）预处理肾小管上皮细胞24 h。④干扰对照组：高糖培养基中培养的细胞在加入黄芩苷的同时，通过Lipofectamine 2000 对肾小管上皮细胞转染si-control（si-Nrf2 的阴性对照），24 h 后收集细胞。⑤Nrf2 干扰组：高糖培养基中培养的细胞在加入黄芩苷的同时，通过Lipofectamine 2000 对肾小管上皮细胞转染si-Nrf2（Nrf2 的小干扰RNA），24 h 后收集细胞。

1.6.3 MDA 表达检测 按照MDA 试剂盒说明书操作方法检测MDA 的含量。取处理后的细胞至1.5 ml离心管中，按说明书步骤加入样本和试剂，混匀后，沸水浴40 min，流水冷却后，10 000 r/min 离心10 min，取200 μl 上清液于96 孔板，并于酶标仪532 nm 波长处读取吸光度值。

1.6.4 流式细胞术检测肾小管上皮细胞凋亡 取肾小管上皮细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，经 1 000 r/min 离心5 min，弃上清液并用磷酸盐缓冲液洗涤2 次。加入Annexin V-FITC（5 μl）和碘化丙啶（PI）（10 μl），室温下避光孵育5 min 后，用FACS Verse 流式细胞仪通过荧光激活细胞分选术检测细胞凋亡情况。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPPS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，两组比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠尿白蛋白水平

对照组、DN 组和干预组小鼠尿白蛋白水平分别为（15.312±3.684）、（141.133±14.467）和（83.222± 13.567）mg/L，经方差分析，差异有统计学意义（F=27.512，P=0.001）。进一步两两比较，DN 组小鼠的尿白蛋白水平较对照组高（t=-5.167，P=0.000）；干预组小鼠的尿白蛋白水平较DN 组低（t=4.867，P=0.002）。此外，普通光学显微镜观察结果显示，DN 组小鼠的肾小管扩张变形，而干预组小鼠的肾小管扩张变形程度减轻。见图1。

2.2 黄芩苷对DN 小鼠肾组织中Nrf2 蛋白表达和ARE 活性的影响

干预组小鼠肾组织中Nrf2 的蛋白表达水平高于DN 组。干预组小鼠肾组织中的ARE 活性为DN 组的（1.600±0.200）倍，两者比较，差异有统计学意义（t=-5.233，P=0.000），干预组小鼠ARE 的活性大于DN组。见图2。

2.3 激活Nrf2 对小鼠肾组织中ARE 活性及肾小管上皮细胞凋亡的影响

激活组的Nrf2 蛋白表达水平高于高糖组；激活组的ARE 活性为高糖组的（1.590±0.080）倍（t=-4.233，P=0.000）；高糖组和激活组MDA 含量分别为（21.333±2.631）和（8.667±2.234）nmol/mg，两组比较差异有统计学意义（t=7.412，P=0.003）；高糖组和激活组肾小管上皮细胞凋亡率为（16.667±2.122）%和（10.333±3.167）%，两组比较差异有统计学意义（t=9.124，P=0.031）。与高糖组比较，激活组ARE 的活性增强，而MDA 的含量减少，肾小管上皮细胞凋亡数目降低。见图3。

2.4 黄芩苷对Nrf2-ARE 信号通路的影响

黄芩苷组的Nrf2 蛋白表达水平高于高糖组，黄芩苷组的ARE 活性为高糖组的（1.710±0.111）倍。黄芩苷组ARE 的活性大于高糖组（t=-6.533，P=0.000）。见图4。

2.5 干扰Nrf2 对小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

4 组MDA 和细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较后发现，与高糖组比较，黄芩苷组肾小管上皮细胞中MDA 的表达降低（t=3.748，P=0.000），细胞凋亡数目减少（t=2.667，P=0.027）；与干扰对照组比较，Nrf2 干扰组肾小管上皮细胞中MDA的表达升高（t=-5.968，P=0.001），细胞凋亡数目增多（t=-3.445，P=0.035）。见表1。

图1 各组小鼠肾小管病理切片（HE 染色×400）

图2 两组小鼠肾组织中Nrf2 蛋白表达 和ARE 活性的比较

图3 激活Nrf2 对小鼠肾组织中ARE 活性 及肾小管上皮细胞凋亡的影响

图4 黄芩苷对Nrf2-ARE 信号通路的影响

表1 干扰Nrf2 对小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响（±s）

表1 干扰Nrf2 对小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响（±s）

注：①与高糖组比较，P＜0.05；②与干扰对照组比较，P＜0.05。

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3 讨论

DN 是糖尿病微血管并发症之一，其发病机制是一个极其复杂的过程，与多种因素有关，包括高血压、遗传、氧化应激、肾脏血流动力学和血管活性物质异常、高血糖症、局部肾素-血管紧张素系统的激活，以及促炎症细胞因子的增加等[14-16]。尿白蛋白增多是肾小球损伤的标志，也是DN 发病的早期临床表现[17]。肾小球高滤引起尿白蛋白增多，加重系统性高血压，最终导致肾功能的逐渐丧失。目前，DN 的治疗重点是改善血糖和控制血压，而对肾脏的功能几乎没有改善[18]。因此，寻找能改善DN 患者肾功能的药物具有潜在的临床意义。

黄芩苷是黄芩中黄酮类成分之一，研究显示黄芩苷对急性肝损伤[19]、脑缺血损伤[20]、脓毒症[7]、牙周炎[21]及结肠炎等[22]具有缓解作用。KONG 等[23]发现黄芩苷能通过抗氧化和旁分泌作用保护离体大鼠心肌免受再灌注损伤。LIU 等[24]报道说黄芩苷能减轻二氧化硅诱导的炎症性纤维化肺疾病。此外，LIN 等[10]表明黄芩苷通过抑制炎症反应和线粒体介导的细胞凋亡发挥对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。本研究发现黄芩苷能够降低DN 小鼠尿白蛋白，说明黄芩苷能有效减少蛋白尿的形成，这有助于缓解早期DN 的肾脏功能。对DN 小鼠肾组织的检测发现，黄芩苷能促进Nrf2 的表达，增强ARE 的活性。因此，笔者推测黄芩苷可能通过调控Nrf2-ARE 信号通路来发挥其肾保护作用。

Nrf2 作为一个亮氨酸拉链转录因子，于1994年首次被发现[25]。目前，Nrf2 被认为是抗氧化反应的“总开关”，能够介导多种氧化应激相关基因的表达，包括抗氧化蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型解毒酶、转运蛋白、蛋白酶体亚基以及一些转录因子等[26-27]。ARE 是细胞保护基因启动子调控区的一段保守序列，该序列能被Nrf2 激活[27]。研究显示Nrf2-ARE 信号通路对某些疾病具有一定的调节作用。LIANG 等[28]研究发现，白藜芦醇能激活Nrf2/ARE 信号通路来减轻炎症反应和氧化应激，从而缓解心肌缺血再灌注损伤。HUANG 等[29]报道虎杖苷通过活化Nrf2-ARE 信号通路来抑制DN 的发展。本研究发现，在高糖培养的小鼠肾小管上皮细胞中，黄芩苷能提高Nrf2 的表达水平和ARE 的活性，降低脂质过氧化反应产物MDA 的含量并抑制肾小管上皮细胞凋亡，而si-Nrf2 能逆转黄芩苷的作用。由此说明，黄芩苷可通过激活Nrf2-ARE 信号通路抑制肾小管上皮细胞凋亡。

综上所述，黄芩苷对DN 小鼠肾脏保护的机制可能是通过激活Nrf2-ARE 信号来提高肾的抗OS 能力，进而抑制DN 的发展。这为DN 的治疗提供了一个新的研究方向。