造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血合并肢带型肌营养不良1 例报告并文献复习

李 越 王晓东 张小玲 易 梦 刘四喜

深圳市儿童医院（广东深圳 518000）

地中海贫血（thalassemia，TM）是全球累积人数最多的常染色体隐性单基因遗传的慢性溶血性疾病。造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前临床根治重型β-TM 的唯一方法。肢带型肌营养不良症（limb-girdle muscular dystrophy，LGMD）是一组以近端肌（骨盆带肌和肩胛带肌）肌无力为主要表现的高度异质性遗传性肌病[1]，总患病率为(1.63～ 5.00)/10万[2]。LGMD尚缺乏有效的治疗方法，目前干细胞移植为研究热点，但其确切疗效及安全性尚不明确。本文回顾分析1例应用同胞HLA全相合HSCT治疗的重型β-TM合并LGMD2型患儿的临床资料，并复习国内外文献。

1 临床资料

患儿，女，3岁5个月，体质量13.3 kg。患儿11个月起出现乏力、纳差，确诊为β-TM，重型，CD 17 纯合子突变，规律输血及排铁治疗。3 岁时无诱因出现肌酶逐渐增高，右下肢行走稍乏力。父母为第3 代近亲结婚。体格检查：四肢肌肉无明显萎缩，四肢近端及远端肌力5 级。实验室检查：血清肌酸激酶（CK）20 802 IU/L。肌电图示左侧胫骨前肌、三角肌、近端肌呈混合性病损，远端肌肌源性损害。左侧股四头肌肉活检可见大量不透明肌纤维，少部分肌纤维变性、坏死及再生。肌肉组织免疫组化可见抗肌萎缩蛋白（dystrophin，Dys）表达。神经肌肉病基因检测示在LGMD 2 型相关的致病基因SGCB外显子区域检测到纯合子突变（c.647T＞A）。检索HGMD、Clinvar、dbSNP147等数据库，均未见相关文献报道。采用保守性预测软件SIFT，蛋白结构预测软件Polyphen2和蛋白结构预测软件MutationTaste，预测该突变为恶性突变，导致氨基酸改变p.L 216 X（亮氨酸＞终止），对蛋白的功能影响较大，符合ACMG相关指南的致病性级别，其父母及妹妹均为c.647T＞A的杂合突变（图1）。

图1 SGCB 基因测序结果

经医院伦理委员会批准，患儿行造血干细胞移植。供者为患儿妹妹，2岁，HLA配型10/10位点匹配，经严格体检各项指标符合造血干细胞供者标准。其接受粒细胞-集落刺激因子10 μg/(kg·d)，皮下注射，共5 天，第6 天采集骨髓血406 mL，获得单个核细胞11.3×108/kg，CD34+细胞13.73×106/kg。预处理方案：环磷酰胺55 mg/(kg·d)，移植前第10～9天静脉滴注；氟达拉滨40 mg/(m2·d)，移植前第2～6天静脉滴注；白消胺3.2 mg/（kg·d），移植前第5～8天静脉滴注；抗人胸腺细胞免疫球蛋白（费森尤斯）7.5 mg/（kg·d），移植前第1～3天静脉滴注。移植物抗宿主病（graft versus-host disease，GVHD）预防：甲氨蝶呤10 mg/(m2·d)，移植后第1天静脉滴注，7 mg/(m2·d)，移植后3、6天静脉滴注；环孢素3 mg/(kg·d)，移植前第1天起静脉滴注，维持环孢素血药浓度（200±50）ng/mL 后，改为7.5 mg/(kg·d)口服，并根据血药浓度调整用药剂量，若无GVHD 发生，移植后18 个月停药；吗替麦考酚酯30 mg/(kg·d)，移植后第1天口服，若无GVHD发生，移植后第30天停药。移植后相关支持治疗：更昔洛韦预防巨细胞病毒感染，伏立康唑预防真菌感染；血小板生成素300 U/(kg·d)，移植后第3～9天应用；移植期间输注辐照去白B型血小板和洗涤红细胞,保持患儿血红蛋白＞90 g/L，血小板＞20 ×109/L；肝素加熊去氧胆酸预防肝小静脉闭塞症。定期用聚合酶链反应-短串联重复序列分析（PCR-STR）检测外周血供体和受体的短片段核苷酸重复序列，检测供体干细胞植入状态。移植后2年对患儿的血细胞计数、植入状态、肌酸激酶水平、肌力等进行观察。移植后中性粒细胞植入时间为移植后第15天，红细胞和血小板植入时间均为移植后第16天。移植后第15、22天的植入证据提示受者体内为混合嵌合状态，嵌合率分别为87.4%和91%。第29 天后植入证据均提示完全供者嵌合。移植前后患儿血清酶无明显下降，CK维持在20 000～25 000 IU/L，血清乳酸脱氢酶波动在1 000～1 500 IU/L；肌电图示左侧胫骨前肌、三角肌、近端三角肌未见明显正峰电位，近端肌呈混合性病损，远端肌肌源性损害。患儿四肢肌力逐渐下降，近期双下肢肌力3～4级，双上肢肌力4级，易摔倒。

2 讨论

本例患儿是首次报道的同时患有重型β-TM 和LGMD2E。目前认为HSCT是唯一可治愈重型β-TM的方法，且生活质量明显高于传统输血和去铁治疗的患者。自1981 年报道首例HSCT 治疗TM 成功后，国际上应用HSCT 治疗重型β-TM 已超过4 000 例。欧洲血液及骨髓移植中心总结2001 年1 月－2010 年12月HSCT治疗TM的临床资料，1 061例18岁以下重型β-TM 患者接受HLA 全相合同胞供者HSCT，2 年总生存率和无病生存率分别为（91±1）%和（83±1）%[3]。

LGMD 与基因突变引起的肌细胞蛋白功能缺陷有关，受累蛋白涵盖肌纤维所有结构。根据遗传方式分为常染色体显性遗传LGMD 1 型（LGMDlA～1 H）和常染色体隐性遗传LGMD2型（LGMD2A～2Z）两种类型。目前已鉴定出8个显性基因和23个隐性基因位点突变[4]，儿童期发病的重度LGMD主要与SGCG、SGCA、SGCB或SGCD基因突变有关[5]，上述4个基因编码的蛋白产物组成多聚糖复合物，有助于维持肌营养不良蛋白-肌营养不良聚糖复合物以及质膜细胞骨架的稳定性。LGMD2E属肌聚糖蛋白病，致病基因为SGCB基因，其定位于染色体4q11，由6个外显子组成。LGMD2E通常于儿童早期发病，近端肌受累为主，下肢更加明显，伴翼状肩胛、小腿肥大、巨舌症、关节挛缩和脊柱侧弯，多于青春期丧失行走能力，部分出现呼吸肌无力，晚期可出现心脏受累[6-7]。

LGMD不同亚型发病年龄、病情严重程度存在异质性。LGMD 目前以综合支持治疗为主，缺乏有效改善病情的治疗方案，干细胞移植及基因编辑有望成为有应用前景的治疗方法。干细胞移植可增强肌营养不良患者受损和退化肌细胞的再生能力[8]，但也存在诸多挑战。首先，骨骼肌是人体最丰富的组织，因此需要大量可移植的祖细胞（每公斤数百万）。其次，移植物植入的途径显著影响疗效[9]，注射部位至受损肌肉组织的迁移率有限，动脉内注射是另一种选择，但仅限于有脉管迁移能力的细胞（如mesoangioblasts和CD 133+细胞）[10]，因此临床上肌营养不良疾病的干细胞移植主要采取多点肌肉注射或联合静脉移植。此外，复杂的免疫反应进一步损害细胞移植的结果，来自成肌细胞移植研究的数据表明，90%的供体细胞在移植后第一个小时内通过细胞介导的免疫反应被清除[11]。最后，肌营养不良患者的肌肉处于持续炎症状态，免疫细胞浸润可能会阻碍移植干细胞向功能性肌肉组织的广泛迁移、增殖和分化。现在临床上开展了多种干细胞移植治疗LGMD，但结果有争议。后续研究表明骨髓来源干细胞通过直接融合参与肌纤维形成，但体内外均无法分化为肌细胞[12]。LGMD动物模型建立困难，缺乏动物实验和基础研究，有关LGMD的干细胞移植的临床应用报道较少。以“肢带型肌营养不良”、“移植”为关键词检索维普数据库、万方数据库及中国知网数据库自建库至2019 年8 月收录的文献，检索到1篇文献[13]。该文献报道对33例LGMD患者进行骨髓干细胞的局部肌肉及经静脉双重移植，移植后患者肌力增强，日常生活活动能力增加，临床症状改善，肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶值下降，肌酐值有升高，远期疗效仍有待进一步观察。以“Limb-girdle muscular dystrophy”、“cell transplant”为关键词检索PubMed、Web of Science 数据库自建库至2019年8月收录的文献，仅检索到1 篇文献。该临床试验采用自体骨髓来源的单个核细胞经鞘内和肌肉特定运动点肌注治疗150 例肌营养不良患者，其中20 例LGMD，联合移植后强化康复训练，随访1年，86.67%患者肌肉力量和生活质量得到改善[14]。本例重型β-TM 合并LGMD 2 E 患儿采用同胞HLA 全相合HSCT，评估移植后肌病改善情况，结果显示移植后完全供者嵌合，造血功能恢复，但肌酶无改善，病情进展。这可能与本例患儿采取异基因HSCT 存在干细胞数量不足、免疫排斥以及迁移效率低有关，无法达到修复作用。

干细胞移植治疗肌营养不良症可能会短期增加患者肌力，提高生活能力，降低血清肌酶水平，改善肌电图等指标，但远期疗效有待观察。目前已发现来自人体不同组织、不同发育阶段具有肌源转化能力的干细胞群，移植治疗需克服的最大问题是植活和向受损肌肉组织的迁移，因此候选干细胞需具备强大的增殖能力和高效的肌源转化率[15]。未来需不断优化移植策略，尤其是增强干细胞增殖、分化和迁移能力，并深入研究移植后的免疫反应，或联合基因疗法[16]，以期改善肌营养不良患者长期生存质量。