分光光度法和液相-质谱联用法检测奶粉中的左旋肉碱

王冬梅，杨明，邱肖依，胡筱静，朱有涛，康翠欣

武汉食品化妆品检验所（武汉 430000）

左旋肉碱（L-carnitine），又称左卡尼汀、肉毒素或维生素BT，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，对人体无不良反应[1]。肉碱属于类维生素，是人体自身合成的营养，是一种天然的物质。左旋肉碱主要添加于婴儿奶粉、老年人食品及运动员、高强度作业者食品和饮料中[2-3]。左旋肉碱作为营养强化剂用于婴儿食品，在维持婴儿生命及促进婴幼儿发育的某些生理过程中发挥着重要的作用，如生酮作用、氮代谢[4]，所以左旋肉碱对婴幼儿来说是一种重要的营养物质。GB 10765—2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》规定，左旋肉碱为可选择性加入成分，规定最小添加量为0.3 mg/100 kJ[5]。

试验以婴儿奶粉为研究基质，分别采用高效液相色谱质谱联用法和分光光度法进行检验，对两种方法的回收率、精密度检验结果进行比较，同时说明两种方法的检测结果是否存在显著的差异。

1 材料、试剂和仪器

1.1 仪器与设备

SCIEX 4500 QTRAP串联质谱仪（配有可用于电喷雾电离的Turbo V离子源），美国AB SCIEX公司；LC 30A液相色谱仪（日本岛津公司）；电子分析天平（ME204/02），METTLERTOLEDO，Switzerland；UV-2700紫外可见分光光度计，日本岛津有限责任公司；实验室pH计，FE20，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。

1.2 试剂

盐酸（分析纯）、甲酸（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），试验用水为二次蒸馏水；高氯酸（HClO4）、氢氧化钠（NaOH）、氢氧化钾（KOH）、2-硝基苯甲酸（C14H8N2O8S2）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（C8H18N2O4S）、乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2·2H2O）、乙酰辅酶A（Acetyl CoA），在2～8 ℃保存；乙酰肉碱转移酶（CAT）：在2～8 ℃保存。

2 样品测定方法

2.1 紫外分光光度法分析步骤[6-7]

2.1.1 标准溶液配制

左旋肉碱标准储备液（80 μg/mL）：准确称取20 mg（精确0.000 1 g）于102±2 ℃烘箱中烘2 h的左旋肉碱，用水定容至250 mL容量瓶中。此液置于4 ℃冰箱中可保存1个月。

左旋肉碱标准工作液：分别吸取0.5，1，2，3和5 mL左旋肉碱标准储备液于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。此溶液仅限于当天使用。

2.1.2 试样处理

1) 准确称取5 g（精确到0.000 1 g）混合均匀的固体样品于烧杯中，用30 mL 40 ℃温水溶解，转入100 mL容量瓶中。加入10 mL 13% HClO4溶液，混合均匀后静止20 min，用蒸馏水定容至刻度，混匀，用定量滤纸过滤。

2) 取20 mL滤液，用4 mol/L KOH溶液调pH至12.5～13.0后，于40 ℃水浴60 min。冷却后用13% HClO4调pH至7.0～7.5。将样液转入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4 ℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤后备用。

2.1.3 标准曲线的绘制

吸取2.0 mL左旋肉碱标准工作液于1 cm比色皿中，加入0.8 mL显色工作液和100 μL乙酰辅酶A溶液，盖上比色皿盖，混合均匀后放入分光光度计中，分光光度计的波长调为412 nm，5 min后归零。迅速加入100 μL乙酰肉碱转移酶溶液，混合均匀后放入分光光度计中，反应10 min后记录吸光度。以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作标准曲线。

2.2 高效液相色谱质谱联用[7-8]

2.2.1 仪器分析条件

色谱柱XBridgeTMBEH HILIC（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）Column XP；流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈。流速：0.3 mL/min。柱温：40 ℃。进样量：2 μ L。洗脱梯度程序见表1。

表1 洗脱梯度程序

2.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子化源（AJS ESI源），正离子多反应监测模式（MRM）检测。离子喷射电压5 000 V，温度500 ℃，源内气体1（gs1，N2）压力50 psi，源内气体2（gs2，N2）压力50 psi，气帘气体（N2）压力35 psi。采用切换法，左旋肉碱在4.22 min左右出峰，将2～6 rain的流出液导入离子源进行分析。左旋肉碱的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数如表2所示。

表2 左旋肉碱的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数

2.2.3 标准溶液配制

精密称取左旋肉碱，用水溶解，配制成80 μg/mL的储备液，再用蒸馏水稀释，配制成1 μg/mL的中间液。中间液用蒸馏水稀释成系列对照溶液供分析用。

2.2.4 样品的前处理

称取8 g均匀样品于50 mL离心管中，加入40 mL水，涡旋混匀1 min，取2.5 mL上述混匀样品，转移至50 mL离心管中，加入1.5 mL水，再加入16 mL乙腈-水（3︰1，V/V），提取液涡旋混匀1 min，再加入5 mL氢氧化钾水溶液（1 mol/L）涡旋混匀1 min，于60℃水浴振荡提取30 min，静置在冷水浴中，冷却至室温，加入5 mL盐酸水溶液（1 mol/L）涡旋混匀1 min，取1.8 mL混合液至离心管，以14 000 r/min离心5 min，取上清液，过微孔滤膜，用水稀释100倍，供高效液相色谱-质谱联用仪分析。

3 结果对比

3.1 紫外分光光度计法标准曲线

用紫外分光光度计法制定的标准曲线如图1所示。在0～16 μg/mL范围内，用分光光度计测得的标准曲线线性关系很好。

图1 紫外分光光度计标准曲线

3.2 液质联用标准曲线、检出限

以0，2，10，50和200 ng/mL质量浓度左旋肉碱标液为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程Y=7.92×104X+2.76×104，R2=0.998，说明在0～200 ng/mL范围内，呈现良好线性关系。结果见表3。

液质联用检出限：取储备液逐级稀释，进样量为2 μ L。以信噪比S/N=3计算左旋肉碱的检出限（LOD），以信噪比S/N=10计算其定量下限（LOQ），并以标准品的质量进行计算，得到左旋肉碱的LOD为0.109 μg/kg，LOQ为0.364 μg/kg，能够满足实际样品分析对检测限的要求。

3.3 两种方法结果对比

3.3.1 两种方法回收率结果

以市场购买的婴幼儿乳粉作为基础样品，分别添加5，10，15和20 mg/100 g标准物质，采用分光光度法和液质联用法进行测定，每个样品检测2次，对其回收率和精密度进行比较，两种方法的加标回收率及相对标准偏差见表4。分光光度法的回收率为96.20%～101.40%，相对标准偏差为0.24%～1.95%。液质联用法的回收率为97.70%～103.80%，相对标准偏差为1.51%～2.94%。两种方法的回收率均良好。

表3 液质联用标准曲线

表4 两种方法的加标回收率及相对标准偏差比较

3.3.2T检验和F检验结果

分别用分光光度法以及液质联用法多次测定同一种样品中的左旋肉碱的含量，结果见表5。

表5 分光光度法与液质联用法测定左旋肉碱的数据对比

分别用F检验和T检验分析分光光度法与液质联用法的检测结果，其中F-检验双样本方差分析的结果见表6，T检验双样本等方差假设的结果见表7。

从F检验的结果来看，p＞0.05，说明两种方法数据的方差无显著差异，检验平均值时应采用等方差t检验。

表6 F-检验双样本方差分析

从T检验的结果来看，p＞0.05，说明两种方法数据的平均值无显著差异。从平均值结果也可以看出，液质联用法的平均值比分光光度法的平均值大0.10 mg/100 g，这可能是分光光度法的核心为酶反应和显色反应，因此效率并非100%，所以分光光度法的结果略低于液质联用法。但两种方法的检测结果并无显著差异。

表7 T-检验：双样本等方差假设

4 结论

通过分光光度法和液质联用法进行左旋肉碱的加标回收率的和精密度的比较，结果发现两种方法的回收率均良好，均适用于婴幼儿乳粉的检测。另外对两种方法的检验结果进行数据分析，通过F检验，发现两种方法的方差无显著差异；通过T检验发现，两种方法的平均值也无显著差异。两种方法均可作为婴幼儿乳粉中左旋肉碱含量的检测方法，实际应用过程中，可根据样品量，设备价格等多方面考虑选择。