马齿苋不同溶剂提取物的抗氧化活性

林宝妹，张帅，洪佳敏，邱珊莲，张少平，郑开斌*

福建省农业科学院亚热带农业研究所（漳州 363005）

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科马齿苋属的草本植物，广泛分布于热带、亚热带地区，常作为中药用于利尿、解热、止痉、抗菌、杀虫等治疗[1]。马齿苋营养成分丰富，含有多种人体必需氨基酸、维生素及矿质元素，营养价值高[2]。马齿苋化学成分多样，分离鉴定的马齿苋化学成分主要有多糖、黄酮、萜类、生物碱、挥发油以及酸类物质如有机酸、不饱和脂肪酸等生物活性物质，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、降血糖、降血脂等多种药理学功效[3]，成为国内外学者的研究热点。国内外对马齿苋活性成分的研究多数为多糖、黄酮、生物碱及不饱和脂肪酸，而对酚类成分研究较少，此外不同溶剂提取对马齿苋抗氧化能力影响的研究也较为薄弱。姚秋萍等[4]采用水、60%乙醇、90%乙醇、丙酮和氯仿为溶剂提取马齿苋活性成分，并测定各提取物对DPPH·、·OH和O2-·清除能力。与之相比，试验采用水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮等具有极性梯度的4种溶剂提取马齿苋活性成分，并分析测定提取物中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性，为马齿苋抗氧化活性成分的提取与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马齿苋（采自福建省农业科学院亚热带农业研究所试验田）。

1, 1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS+）、邻二氮菲（美国Sigma公司）；标准品没食子酸、芦丁（纯度＞98%，日本东京化成工业株式会社）；TPTZ（纯度99%，上海麦克林生物技术有限公司）；抗坏血酸（VC）、氯化铁、醋酸钠、冰醋酸、无水乙醇、95%乙醇、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计（L5S型，上海仪电分析仪器有限公司）；超纯水机（UPW-20N型，北京历元电子仪器有限公司）；分析天平（BS 110 S型，德国Sartorius集团）；粉碎机（WBL 2521H型，佛山美的集团）；冷冻高速离心机（MIKRO-22 R，德国Hettich）；台式冷冻恒温振荡仪（THZ-C-1，苏州培英实验设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物制备

将采集的新鲜马齿苋挑拣清洗除去泥沙与残叶，于60 ℃热风干燥箱中烘干至恒质量。干燥马齿苋于粉碎机中粉碎（28 000 r/min）40 s，过40目筛，备用；以水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮为提取溶剂，取适量马齿苋粉末，按照料液比1︰30（g/mL），180 r/min，于28 ℃恒温振荡箱中提取1 h，获得马齿苋不同溶剂提取物，提取物于冷冻离心机中以6 000 r/min离心15 min，取上清液，待测。提取液质量浓度以每毫升提取液所含的原材料质量计，单位为mg/mL。

1.3.2 总多酚含量测定

参考Tohidi等[5]的方法，采用福林酚法。将马齿苋不同溶剂提取物用超纯水稀释成10 mg/mL，取0.5 mL样品于试管中，加入2.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocalteu试剂和2 mL 75 g/L碳酸钠溶液，摇匀，45 ℃水浴反应15 min，于765 nm处测吸光度。按照上述方法，以没食子酸为标准品，以没食子酸质量浓度为x轴，吸光度为y轴绘制回归曲线。不同溶剂提取物的总多酚含量以每克原材料含有的没食子酸质量计，单位为mg/g。

1.3.3 总黄酮含量测定

参考邱珊莲等[6]的方法，采用亚硝酸钠-氯化铝反应体系。将马齿苋不同溶剂提取物用超纯水稀释成10 mg/mL，取1 mL样品液，加入0.5 mL 50 g/L亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min后加入0.5 mL 100 g/L硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，加入4 mL 40 g/L氢氧化钠溶液，加入水定容至10 mL，静置15 min，于510 nm处测其吸光度。按照上述方法，以芦丁为标准品，以芦丁质量浓度为x轴，吸光度为y轴绘制回归曲线。不同溶剂提取物的总黄酮含量以每克原材料含有的芦丁质量计，单位为mg/g。

1.3.4 抗氧化能力评价

1.3.4.1 DPPH·清除能力

参照Tang等[7]的方法。分别取1 mL样品于试管中，加1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH·的无水乙醇溶液，摇匀后置于暗处反应30 min，于517 nm处测定吸光度A1；同时设置空白对照组A0（以超纯水代替样品）和样品本底组A2（以无水乙醇代替DPPH·溶液），按式（1）计算DPPH·清除率。按照上述方法测定VC对DPPH·的清除率。

1.3.4.2 ABTS+清除能力

参照袁媛等[8]的方法，并稍作修改。配制ABTS+储备液，7 mmol/L ABTS+与2.45 mmol/L过硫酸铵等体积混合，暗处静置16 h。测定前，将ABTS+储备液用乙醇稀释，使其在734 nm处吸光度为0.70±0.05，为反应工作液。取0.1 mL样品于试管中，加入3.8 mL ABTS+反应工作液，摇匀后置于暗处反应6 min，于734 nm处测定吸光度A1，同时设置空白对照组A0（以超纯水代替样品）和样品本底组A2（以乙醇代替ABTS+反应工作液），按式（2）计算ABTS+清除率。按照上述方法测定VC对ABTS+的清除率。

1.3.4.3 ·OH清除能力

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定[6]。2 mL pH 7.4磷酸盐缓冲液和0.5 mmol/L邻二氮菲的70%乙醇溶液、0.5 mmol/L硫酸亚铁、样品各1 mL依次加入试管中，加入1 mL 0.1%过氧化氢溶液，于37 ℃水浴中反应1 h，反应结束后于510 nm处测定吸光度A1，以超纯水代替样品为损伤组A2、以超纯水代替0.1%过氧化氢溶液和样品为未损伤组A0，按式（3）计算·OH清除率。按照上述方法测定VC对·OH的清除率。

1.3.4.4 总抗氧化能力测定

参考曹珍珍等[9]的方法，采用FRAP法测定提取物总抗氧化能力。配制FRAP反应试剂，将pH 3.6 0.3 mmol/L醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl配制）、20 mmol/L氯化铁溶液按照体积比10︰1︰1混合，于37 ℃水浴保温30 min待用。将0.2 mL样品与6 mL FRAP试剂混匀，37 ℃水浴反应25 min，于593 nm处测定吸光度。以VC（抗坏血酸）水溶液为标准绘制标准曲线，结果以mg VC/g干质量表示。

1.4 统计分析

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行回归曲线的制作；采用SPSS 22.0统计软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以质量浓度0.010～0.080 mg/mL没食子酸测得的吸光度建立回归方程：y=10.697 x+0.014（R2=0.998 2）。没食子酸在试验所设质量浓度范围内与吸光度有良好的线性关系，如图1（a）所示。

由图1（b）可见，芦丁质量浓度在0.200～0.600 mg/mL内，其质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，获得回归方程y=1.258x-0.021，R2=0.996 8，曲线拟合度好。

图1 没食子酸（a）和芦丁（b）标准曲线

2.2 总多酚和总黄酮含量

由图2可见，马齿苋不同溶剂提取物总多酚含量在8.615～11.323 mg/g之间，各提取物总多酚含量从高到低依次为：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。70%乙醇提取物和水提取物的总多酚含量较为接近，分别为8.874±0.084 mg/g和8.615±0.038 mg/g。马齿苋70%乙醇提取物总黄酮含量最高，为12.415±0.200 mg/g，稍高于70%甲醇提取物（12.237±0.651 mg/g）；水提取物总黄酮含量最低，为6.815±0.159 mg/g，约为70%乙醇提取物的1/2；70%丙酮提取物的总黄酮含量居于中等水平，为8.569±0.230 mg/g。

图2 马齿苋不同溶剂提取物总多酚和总黄酮含量

2.3 马齿苋不同溶剂提取物抗氧化能力

2.3.1 DPPH·、ABTS+、·OH清除能力

由表1可知，在试验的浓度范围内，马齿苋不同溶剂提取物对DPPH·、ABTS+、·OH等3种自由基的清除作用随着提取物质量浓度的升高而增强，二者呈线性关系，R2＞0.97。对DPPH·、ABTS+、·OH的清除能力大小顺序依次均为：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。其中水提取物在试验所设最高质量浓度30 mg·mL-1时，其对·OH的清除率为45.23%，未超过50%，因此未获得其对·OH的EC50值。马齿苋不同溶剂提取物清除自由基能力大小为DPPH·＞ABTS+＞·OH，即对DPPH·清除能力最强，对·OH清除能力最弱。但以上马齿苋4种溶剂提取物对DPPH·、ABTS+、·OH的清除能力均小于抗坏血酸。

2.3.2 总抗氧化能力

由图3可见，抗坏血酸的质量浓度在0.100～0.800 mg/mL，其质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，R2=0.999 4，曲线拟合度好，回归方程为y=1.009x+0.036，即随着抗坏血酸质量浓度升高，FRAP抗氧化反应体系中的Fe3+不断被还原为Fe2+，吸光度最高可达0.849。将各提取物反应后的吸光度代入回归方程计算得对应的VC当量，结果如图4所示。马齿苋各溶剂提取物总抗氧化能力大小顺序依次为：70%丙酮提取物＞70%乙醇提取物＞70%甲醇提取物＞水提取物。70%丙酮极性最小，Fe2+还原量最多，总抗氧化能力最强。

表1 马齿苋不同溶剂提取物自由基清除效果的比较

图3 VC总抗氧化能力回归曲线

图4 马齿苋不同溶剂提取物总抗氧化能力

2.4 抗氧化活性、总多酚和总黄酮含量的相关性

如表2所示，马齿苋提取物总多酚含量与总抗氧化能力呈显著性正相关（p＜0.05），随着总多酚含量上升，总抗氧化能力增强，马齿苋不同溶剂提取物的总多酚含量可在一定程度上反映总抗氧化能力的强弱；总多酚含量与DPPH·、ABTS+清除能力有一定的正相关性，与·OH清除能力间相关性较弱。总黄酮含量与各抗氧化能力的相关性均较小。由表3可知，4种抗氧化方法之间，DPPH·和ABTS+以及DPPH·和FRAP之间显著相关（p＜0.05），其他抗氧化评价方法之间的相关性则较弱。

表2 抗氧化和总多酚、总黄酮含量的相关性

表3 抗氧化评价指标间的相关性分析

3 讨论与结论

多酚类化合物是植物的次级代谢产物，具有较强的抗氧化活性，表现在清除自由基[10]、还原能力[11]、抗油脂氧化[12]等方面。在食品生产过程中，通常会添加合成的抗氧化剂如BHA、BHT、TBHQ等以延缓氧化进程，但是合成抗氧化剂具有潜在的毒性，加之消费者对于天然产品的偏爱，寻找合适的多酚类天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂成为研究热点[13]。通常采用水与甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂的混合液作为多酚的提取溶剂[14]，一方面利用有机溶剂的破壁能力，另一方面利用水提高提取溶剂的极性，达到有效提取目的。

采用DPPH·、ABTS+、·OH、FRAP抗氧化体系评价马齿苋的水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮提取物的抗氧化活性，并测定总多酚和总黄酮含量。结果表明，马齿苋不同溶剂提取物在4种抗氧化评价体系中均表现出一定的抗氧化活性。各溶剂提取物在4种评价体系所得出的抗氧化能力的顺序一致，依次为：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。说明70%丙酮能更有效地提取出马齿苋中的抗氧化活性成分。各提取物对自由基的清除能力均为DPPH·＞ABTS+＞·OH，顺序与VC一致，说明马齿苋提取物中抗氧化活性成分与VC的抗氧化特性相似，对DPPH·的清除能力最强，对·OH的清除能力稍弱。在总抗氧化能力方面，70%丙酮提取物的VC当量可达137.405 mg VC·g-1，而周浩[2]检测到马齿苋中VC的含量仅为0.242 mg/g，说明马齿苋中除了VC外，还有大量还原性物质可发挥抗氧化作用。有机水溶剂提取物中的总多酚和总黄酮均较高，水提取物中二者含量均为最低，说明提取溶剂中含有部分有机溶剂能更好地提取总多酚和总黄酮，以70%丙酮提取物总多酚含量最高。

相关性分析结果表明，总多酚与抗氧化活性间呈较强的正相关性，而总黄酮与抗氧化活性相关性较弱，可能是由于马齿苋中发挥抗氧化活性的物质除了黄酮外还有其他酚类成分。因此，可以选择总多酚含量作为马齿苋抗氧化提取物质量评价的指标。同时，4种抗氧化评价结果之间并未呈相互相关，这可能是由于不同溶剂提取物中具有抗氧化活性的物质结构、性质、含量有所不同导致。另外，不同的抗氧化评价方法机理不同也对结果有一定影响[15]。因此，应采用多种不同抗氧化方法对天然提取物的抗氧化性进行综合评价。

马齿苋总多酚含量可作为抗氧化活性成分提取指标进行天然抗氧化剂的开发应用。有机水溶剂可作为马齿苋抗氧化成分的提取溶剂，其中70%丙酮提取效果较佳，而有关马齿苋抗氧化有效成分的化合物类型需要进一步试验研究。