双孢菇酪氨酸酶的提取纯化及其性质

闵玉涛，宋彦显*，马庆一

1. 郑州工程技术学院（郑州 450044）；2. 郑州轻工业学院（郑州 450002）

双孢菇（Agaricus bisporus）是全球种植范围最广、产量最大的一种食用菌，中国各地均有种植，是中国出口量最大的蘑菇[1]。双孢菇营养丰富，含有8种人体必需氨基酸、维生素、蛋白质、核苷酸等物质[2-3]，具有抗氧化、抗衰老、抑菌、降血糖、预防肥胖、消炎、抗癌等保健作用[4-7]，口味鲜美，深受消费者喜爱，市场空间较大。双孢菇成熟后，水分在90%以上，多酚物质含量多，质地鲜嫩，生理代谢旺盛，在贮运、售卖过程中易褐变，若受机械损伤，褐变加剧，致保鲜期非常短[8]。因此，双孢菇的采后保鲜一直是研究的热点之一[9-12]。

酪氨酸酶（TYR）又称儿茶酚氧化酶、多酚氧化酶等[13]，以酚类及其衍生物、羧酸及其衍生物等为底物[14]，是双孢菇酶促褐变的关键酶。双孢菇中酪氨酸酶可以催化酪氨酸等底物形成二羟苯丙氨酸（多巴），多巴是一种辅助底物，被酪氨酸酶催化形成多巴醌，转化形成黑色素，从而导致褐变。因此，一切可降低或抑制双孢菇酪氨酸酶的条件均可减少黑色素的形成，防止双孢菇酶促褐变。

试验采用丙酮沉淀，硫酸铵盐溶盐析和透析、反渗透相结合的方法提取双孢菇中的酪氨酸酶并部分纯化，研究酶学性质，为双孢菇采后保鲜、防止褐变、延长货架期提供依据，同时为美白和乌发化妆品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢菇（郑州毛庄菜市场）。丙酮（AR级，安徽宿州化学试剂厂）；硫酸铵（AR级，新乡市化学试剂厂）；氟化钠（AR级，莱阳化工实验厂）；磷酸氢二钠（AR级，北京红星化工厂）；磷酸二氢钾（AR级，莱阳化工实验厂）。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（SP-2102 PC型，上海光谱仪器有限公司）；三用紫外分析仪ZF-C型（上海康禾光电仪器有限公司）；高速台式离心机（TGL-18 C型，上海安亨科学仪器厂）；离心沉淀器（80-1型，上海手术器械厂）；组织匀浆机（JJ-2型，金坛市亿通电子有限公司）；高速冷冻离心机（GL型，湖南仪器仪表总厂离心机厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 酪氨酸酶的提取与纯化

双孢菇清洗，去水，切块，按照1︰1比例加入pH 6.8磷酸缓冲液，组织匀浆至浆状，4 ℃，5 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清液即为粗酪氨酸酶液。粗酶液加等体积丙酮沉淀，同上述条件离心，弃上清，加10%饱和(NH4)2SO4溶解沉淀，同条件离心，上清液即为初步纯化酪氨酸酶液。将初步纯化酪氨酸酶液调整(NH4)2SO4饱和度至60%，静止沉淀，同条件离心，用pH 6.8的磷酸缓冲液溶解沉淀，半透膜透析、反渗透，制备酪氨酸酶液。分别测定粗酶液、初步纯化酶液、纯化后酶液酶活力和蛋白含量。

1.3.2 酪氨酸酶活力的测定

参照马庆一等[15]的方法，于波长317 nm处比色法测定酶活力。反应体系为2.5 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸盐缓冲液，于室温（20 ℃左右）中加入0.02 mL纯化后酶液，迅速混匀，使用紫外可见分光光度计，于波长317 nm处比色。酶液加入后开始计时，每30 s记录1次吸光度随时间的变化值，以最初的直线部分计算反应速率。定义吸光度每分钟增加0.001为1个酶活力单位。

1.3.3 酪氨酸酶性质的研究

1) 底物浓度与酶活性的影响

测定不同底物浓度下反应速度随时间的变化。分别取2.0，1.5，1.0，0.8，0.5和0.1 mL含2 mmol/L L-酪氨酸（底物）的pH 6.8磷酸盐缓冲液，加pH 6.8的磷酸缓冲液使总体积均为4 mL，加入0.02 mL酪氨酸酶液，按1.3.2小节在317 nm比色测定酶活力。

2) pH对酶活性的影响

分别取4 mL pH 3～8.5 10种pH的磷酸盐缓冲液（含1 mmol/L L-酪氨酸），25 ℃保温10 min后，立即加入0.02 mL酪氨酸酶液，按1.3.2小节在317 nm比色测定酪氨酸酶的活性。

3) 温度对酶活性的影响

反应体系为4 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸盐缓冲液，在5～60 ℃不同温度的水浴中保温10 min后，立即加入0.02 mL纯化后酶液，混匀后按1.3.2小节在317 nm测定酪氨酸酶活性。

4) 异VC钠对酶活性的影响

以4 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸盐缓冲液为底物，分别测定无抑制剂、加入0.01%异VC钠时酶反应速度随时间的变化，绘制酶反应速度曲线，比较抑制剂对酶活性的影响。

2 结果与讨论

2.1 酪氨酸酶的提取

缓冲溶液粗提应在0～4 ℃下进行，以防止酪氨酸酶失活，缓冲溶液中加入0.1 mol/L NaF，以抑制提取过程中酶促反应的进行，防止褐变的发生，避免酶失活。采用丙酮沉淀酪氨酸酶，整个操作过程控制在0～4 ℃下进行。

2.2 酪氨酸酶的比活力及纯化倍数的测定

粗酶、初步纯化酶液和纯化后酪氨酸酶的酶活力、蛋白含量、比活力和纯化倍数如表1所示。

结果表明，在提纯过程中，第一步经过丙酮沉淀和硫酸铵盐溶，酶活提高5倍，而蛋白质含量却下降近1/2。第二步经过60%饱和硫酸铵盐析，在蛋白质含量没有明显提高情况下，酶活提高近70倍，比酶活提高500余倍，说明经过丙酮沉淀和硫酸铵盐溶，去除部分杂蛋白。试验中盐溶用10%饱和硫酸铵溶液，盐析中硫酸铵用量60%的饱和度，结果证明这样可有效去除杂蛋白，纯化效果明显。

表1 酪氨酸酶纯化过程中的酶活力、蛋白含量、比活力和纯化倍数

2.3 酪氨酸酶的性质

2.3.1 底物浓度与酶活性的关系

根据酶活随底物浓度的变化值，绘制出不同底物浓度酶反应速度曲线，结果如图1所示。

结果表明，底物与酶活呈典型的矩形双曲线，当底物浓度小于0.4 mmol/L时，为一级反应，反应速率和底物浓度呈正比；当底物浓度大于0.804 mmol/L时，反应速率趋近最大反应速率，接近零级反应，反应速率不再随着底物浓度增加而增加。反应动力学符合米氏动力学方程。

图1 底物浓度与酶活的关系

2.3.2 酶促反应动力学方程

采用双倒数作图法，以1/[s]为横坐标，以1/V纵坐标作图，结果如图2所示。

由图2得出的线性方程y=0.013 1x+0.024 1可知，直线在y轴上的截距为1/Vmax=0.024 1，则Vmax=41.5 U/min，在x轴上的截距为-1/Km=-1.840，则Km=0.543 mmol/L。

图2 作图法求Vmax和Km

2.3.3 pH对酶活力的影响

在不同pH条件下，在317 nm处吸光度随时间变化结果，以pH为横坐标，不同pH时的酶活为纵坐标作图，结果见图3。

酪氨酸酶的最适pH为6.5，其在pH 6.5附近保持较高的活性，在pH 6.5以下酶活力与pH呈正相关关系；在pH 6.5时达到最大值；大于pH 6.5时，酶活力与pH呈负相关关系。

图3 pH对酶活的影响

2.3.4 温度与酶活的关系

不同温度时，在317 nm处吸光度随时间变化结果，以温度为横坐标，不同温度时的酶活为纵坐标作图，结果见图4。

酪氨酸酶最适温度为30 ℃，其在30 ℃左右保持较高酶活力，温度对酶活的影响呈“钟罩形”曲线。

图4 温度对酶活的影响

2.3.5 异VC对酶活性的影响

异VC及对照在317 nm处吸光度随时间变化结果，以时间为横坐标，不同时间的吸光度为纵坐标作图，结果见图5。

异VC钠是常用抗褐变剂，它能有效地抑制酪氨酸酶活性，使反应速度减慢，是酪氨酸酶的抑制剂之一。

图5 抑制剂对酶活的影响

3 结论

经过丙酮沉淀和硫酸铵盐溶、盐析、透析和反渗透等方法提取纯化后，酶活力为1 710 U/mL，比活力为357.89 U/mg蛋白，纯化倍数为501.2。L-酪氨酸为底物，双孢菇中酪氨酸酶的Km=0.543 mmol/L，Vmax=41.5 U/min。在pH 5～7之间酶活较高，最适pH为6.5；最适反应温度为30 ℃，异VC能有效抑制酪氨酸酶活性，反应速度与酶量、底物浓度关系均符合酶促反应动力学。