超声辅助酶解大米多肽的制备及其对酵母细胞增殖性影响

李素云，覃颖泉，谢冬梅，张华，李星科，王语迟

郑州轻工业大学食品与生物工程学院（郑州 450002）

大米蛋白是一种优质的植物蛋白，它富含人体所需的各种氨基酸，且组成平衡合理，与其他蛋白相比，大米蛋白还具有较高的生物价[1]，此外，大米蛋白不含致敏因子，是唯一免于过敏实验的谷物蛋白[2]。将大米蛋白经过适度酶解可以制备生物活性肽，由于其分子量较小，更容易被机体吸收，所以其生理功能、营养特性和加工性能都比大米蛋白更为优越。因此通过常规酶解和超声辅助酶解两种方法制取大米多肽，将其用于培养酵母增殖，并对其增殖性进行对比试验研究，从而探寻何种方式制备的大米多肽具有更佳的生理活性。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

大米蛋白，郑州市天顺食品添加剂有限公司，蛋白含量81.34%；碱性蛋白酶：酶活20万 U/g，南京诚纳化工有限公司；酪蛋白胨、酵母氮源、葡萄糖（分析纯）、安琪干酵母、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉。其他试剂为国产分析试剂。

单频聚能式单频超声，频率28 kHz，无锡上佳；PHS-3 TC型pH计，上海天达仪器有限公司；Agilent 1100液相色谱，美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大米多肽的制备

超声辅助酶解：在大米蛋白酶解前对大米蛋白溶液实施超声，然后按照常规酶解方法酶解，酶解工艺按照前期试验优化结果：大米蛋白溶液质量浓度为40 g/L，酶添加量为[E]/[S]=6%，溶液温度为50 ℃、pH为8.5，酶解100 min后灭酶、离心，收集上清液，测定产物的大米多肽得率，考察超声预处理大米蛋白对酶解效果的影响。

1.2.2 超声辅助酶解工艺单因素试验

取800 mL质量浓度为40 g/L的大米蛋白悬浮液在酶解前进行超声预处理。超声参数：超声处理时间为5，10，15，20和25 min；超声功率密度为33，45.5，51.8和65.8（W/L）；料液初始温度为20，30，40和50 ℃。

1.2.3 超声辅助酶解工艺优化

基于单因素试验，以多肽得率CR（%）为指标，选择超声功率密度、超声温度、超声时间为影响因素，因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.2.4 分子量测量

采用Agilent 1100液相色谱系统，对制备的大米蛋白酶解液进行分子量分布测定。流动相组成为乙腈、水、三氟乙酸，比例为体积比45︰5︰0.1；进样和洗脱流速均为0.5 mL/min；色谱柱采用TSKgelG2000（300 mm×7.8 mm），且柱温保持在30 ℃左右；检测波长：UV 220 nm；进样量：10 μL。

1.2.5 培养基及培养条件的确定

大米多肽培养基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L大米多肽、pH 5.5；YPD培养基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固体培养基加20 g/L琼脂粉）。酵母细胞培养在100 mL YPD培养基中，安琪酵母经2代活化后以1%接种量接菌于大米多肽培养基，在30 ℃、120 r/min的摇床培养24 h。

1.2.6 不同浓度大米多肽培养基对酵母细胞增殖影响

将大米多肽配成浓度为10～30 g/L的多肽溶液，测定多肽溶液对酵母细胞增殖影响。

1.2.7 多肽得率的测定

3.平均每个孵化器有注册企业44个。数据显示，孵化器平均场地面积26755.08 m2，共孵化企业1108个，平均每个孵化器孵化44个企业。其中，中科云智国家级科技企业孵化器场地面积最大，达到154000 m2，占所调查孵化器总面积的23%；蜂巢空间孵化企业数最多，达184个，占所调查孵化器企业总数的16.6%。松山湖创新科技园孵化器的孵化效率最低，拥有50000 m2面积，在所调查的25个孵化器中，排名第5位，仅仅只有2家注册企业。

不同超声辅助酶解的大米蛋白悬浊液在离心力为10 000（×g）的冷冻离心机上离心15 min，收集上清液。上清液中蛋白溶出量采用Folin-phenol法测定。多肽得率按式（1）计算。

式中：C表示可溶性肽含量，μg/mL；V表示样品体积，mL；N0表示原料中总氮的含量，mg。

2 试验结果与分析

2.1 超声辅助酶解大米蛋白单因素影响结果分析

2.1.1 超声功率密度对大米多肽得率的影响

在超声频率为28 kHz、超声温度为50 ℃、质量浓度为40 g/L、工作间歇比为2︰2（s/s），超声时间为10 min的条件下进行超声预处理，考察不同超声功率密度对多肽得率的影响，其结果如图1所示。从图1可以看出：随超声功率密度的增大，多肽得率先增大后减少，当功率密度达到51.8 W/L时，多肽得率达到最大值。原因是超声功率过低，不能够提供足够的空化能量使蛋白颗粒得到充分撞击，从而不利于蛋白的释放；但超声强度过大，游离出的蛋白质颗粒重新形成聚集，降低了与酶的接触机会，导致多肽得率的降低[3]。因此，试验选取的最佳超声功率密度为51.8 W/L。

图1 超声功率密度对大米多肽得率的影响

2.1.2 超声温度对大米多肽得率的影响

在超声频率为28 kHz、质量浓度为40 g/L、超声功率密度为51.8 W/L、工作间歇比为2︰2（s/s）、超声时间为10 min的条件下，考察不同超声预处理温度对多肽得率的影响，结果如图2所示。从图2可以看出：随着超声预处理初始温度的升高，多肽得率先增大后减小。产生这一现象的原因可能是：随着超声处理温度的升高，料液中的物料颗粒碰撞加速，但当温度过高时，液体媒介的蒸汽压增加，料液中微小空化泡不能迅速成长-崩溃，空化作用强度减弱[4]。综合考虑上述因素，选取50 ℃为最佳试验温度。

图2 超声温度对大米多肽得率的影响

2.1.3 超声时间对大米多肽得率的影响

在超声频率为28 kHz、超声温度为50 ℃、质量浓度为40 g/L、超声功率为51.8 W/L、工作间歇比为2︰2（s/s）的条件下，考察不同超声处理时间对多肽得率的影响，结果如图3所示。从图3可以看出：超声预处理时间对大米蛋白多肽得率的影响是先增大后减少的。当超声处理时间在5 min内时，大米蛋白多肽的得率呈急速上升，然后增速减缓的趋势。当超声时间大于15 min时，缓慢下降。其原因可能是：在较短的超声时间（＜5 min）内，超声处理有利于发挥其机械效应，使蛋白颗粒细化，增加酶与底物的接触面积，有利于酶解反应的发生；但当超声预处理的时间过长（＞15 min）时，超声波和温度累积的热效应使蛋白的疏水性基团增加过多，进而发生聚集折叠，导致蛋白溶解量下降[5]，酶与底物的接触面积减少，不利于酶解反应的进行。结果表明，超声处理时间15 min为最佳处理时间。

图3 超声时间对大米多肽得率的影响

正交试验结果见表2。按照极差大小，影响超声辅助酶解大米蛋白多肽得率的三个因素的主次顺序依次是：超声处理＞超声功率密度＞超声时间。正交试验得到的优化工艺为：超声功率密度51.8 W/L、超声温度50 ℃、超声时间15 min。在最优工艺下大米多肽得率为70.57%。

表2 超声预处理大米蛋白辅助酶解正交试验

2.2 两种酶解方法对大米蛋白多肽得率和分子量分布影响研究

两种酶解方法对大米蛋白多肽得率和分子量分布影响见表3和表4。从表3可以看出，超声对大米蛋白预处理后，酶解初始反应速率增加迅速。原因可能是超声波的机械效应、声化学效应和碱液的化学作用有助于破坏分子之间的氢键、二硫键交联，使大分子蛋白结构发生降解现象[6]。随着酶解进行到40 min后，方法2的酶解反应速率逐渐变缓慢，与方法1的水解速度差异逐渐减少，到100 min时，水解度相差不大（表3），这是由于大多数的底物在100 min被酶解。但是在相同水解度条件下，与未超声处理相比，方法2更能节省酶解时间。

表4是两种酶解方法对大米蛋白多肽分子量分布影响。从表4可以看出，随着水解时间延长到60 min，超声酶解产物的相对分子量在小分子区间含量远高于对照组，这与表3的研究结果相吻合，从而说明超声辅助酶解能提高酶解效率，缩短酶解时间。

表3 超声预处理对大米蛋白酶解效果影响（酶解100 min）

表4 超声辅助酶解和常规酶解的酶解液分子量分布

2.3 不同浓度大米多肽培养基培养酵母细胞对酵母的影响

表5是不同大米多肽添加量培养基培养酵母24 h后所得的湿重结果。当大米多肽添加量为10～25 g/L时，所得的酵母细胞湿重随着大米多肽添加量的增加而增加，超过25 g/L后增加量不再显著，表明培养基中25 g/L的大米多肽添加量可以获得较好的培养效果。

2.4 两种酶解方法的大米蛋白多肽作为氮源对酵母细胞培养过程的影响

由图4可知，在以25 g/L大米多肽作为氮源的培养基中，未超声的菌液的吸光度增长较慢，达到稳定期所需时间较超声培养基时间长。测量可知：超声的大米多肽培养基中得到的酵母细胞量比未超声培养基中得到的酵母细胞量多，大约是1.1倍，证明大米多肽可以促进酵母细胞的增殖，且与多肽分子量分布有关。

表5 酵母细胞在不同大米多肽添加量培养基中生长后的湿重

图4 两种酶解方法制备大米蛋白多肽作为培养基对酵母细胞生长影响

3 结论

试验对超声辅助酶解制备大米多肽工艺进行了优化，探讨了常规和超声辅助两种酶解方法制取大米多肽对酵母增殖影响，得到如下结论：

1) 超声辅助酶解最优工艺为：超声功率密度51.8 W/L、超声温度50 ℃、超声时间15 min。在最优工艺条件下，大米多肽得率为70.57%；在相同酶解时间内超声辅助酶解液中多肽分子量分布在＜1 000 Da的比例更多。

2) 酵母细胞增殖能力随着多肽浓度的增加而增强，当多肽达到25 g/L时，酵母增殖缓慢。

3) 超声辅助酶解的大米多肽培养基中得到的酵母细胞量比未超声培养基中得到的酵母细胞量多，证明大米多肽可以促进酵母细胞的增殖，且与多肽分子量分布有关。