响应面法优化竹叶香豆素提取工艺

陈艳熙，贾春梅*

宜宾学院（宜宾 644000）

竹叶（Bamboo leaves）为禾本科植物淡竹的叶，中国具有丰富的竹叶资源，且香豆素是竹叶的主要功能活性物质之一，具有重要的医学价值[1]，但国内外关于竹叶香豆素的研究非常少。提取香豆素主要方法有传统溶剂法[2-4]、超声波提取[5]、微波辅助提取[6]、超临界流体萃取法[7-8]等。

此次试验以毛竹叶为原料，在单因素试验基础上，进行四因素三水平的中心组合试验，用软件Design-Expert 8.0.1拟合响应值与影响因素的关系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹叶香豆的素最佳工艺，将最优工艺进行验证。优化竹叶香豆素的提取工艺可促进竹叶资源开发利用，为大规模提取竹叶香豆素提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜毛竹叶（宜宾学院）；伞形花内酯（分析标准品，99%）；芦丁（分析标准品，≥98%）；无水乙醇（分析纯）；石油醚（分析纯）。

TU-1901紫外分光光度计；800Y高速多功能粉碎机；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌机；R-100VN旋转蒸发仪；722可见分光光度计。

1.2 香豆素定量分析方法

1.2.1 制备伞形花内酯标准溶液

精确称取10 mg伞形花内酯，用40%乙醇定容于25 mL容量瓶。从中取5 mL加入一个50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，即得标准溶液（40 μg/mL）。

1.2.2 确定测定波长与参比波长

准备3只10 mL容量瓶，分别加入1.0，2.0和3.0 mL伞形花内酯标准溶液，用40%乙醇定容。在190～900 nm范围内对溶液进行紫外可见光扫描，由图谱可知伞形花内酯的特征吸收波长326 nm，所以选择326 nm为香豆素类化合物的测定波长。

为消除提取液中黄酮类物质干扰，以芦丁为标准品，配制不同浓度芦丁溶液，对芦丁溶液进行紫外可见光扫描，在扫描曲线上找一个与326 nm处吸收相等的波长383 nm，作为参比波长[18]。

1.2.3 绘制标准曲线

准备6只10 mL容量瓶，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL伞形花内酯（40 μ g/mL）标准溶液，用40%乙醇定容。在选定双波长处测定吸光度，将2个吸光度作差，将差值对伞形花内酯浓度线性回归，得到标准曲线，线性回归方程为：Y=0.133 8 X+0.062 3，R2=0.999 1。

1.3 制备样品溶液

采摘宜宾学院新鲜竹叶，用清水洗净，干燥，将干燥后的竹叶进行粉碎，过60目筛，以石油醚溶剂对竹叶进行脱色处理，脱色后的竹叶自然挥干，水浴烘30 min。准确称取8.0 g竹叶，提取溶剂用70%乙醇，于60 ℃提取60 min，液料比30︰1（mL·g-1），提取2次，合并提取液并通过减压旋蒸的方式将提取液中的乙醇旋出，制成浸膏，浸膏用40%乙醇定容至100 mL，得到样品溶液。

1.4 计算样品溶液中香豆素含量

取1 mL样品溶液加入50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，采用双波长法测定吸光度，记录数据，根据线性回归方程计算出样品溶液中香豆素的含量。

1.5 日间精密度和日内精密度

准备3只50 mL容量瓶，分别加入1.0，1.5和2.0 mL样品溶液，40%乙醇定容，采用双波长法测定吸光度，记录数据。测定日内精密度需要在同1 d内，每隔1.5 h测定1次数据，重复5次，测得1.0，1.5和2 mL样品溶液中香豆素的RSD值分别为1.34%，0.874%和0.51%，表明日内精密度良好。测定日间精密度需要连续在5 d的同一时间测定吸光度，记录数据，测得1.0，1.5和2 mL样品溶液中香豆素的RSD值分别为4.42%，2.46%和0.817%，表明日间精密度良好。

1.6 回收率试验

准备3只50 mL容量瓶，分别加入1.0，1.2和1.4 mL样品溶液，1，3和5 mL伞形花内酯标准溶液，用40%乙醇定容，采用双波长法测定吸光度，记录数据，计算回收率，结果显示，标样的回收率分别为103.68%，99.86%和96.68%，回收率在95%～105%之间，回收率的RSD值小于5%，说明检测系统对此试验的测定结果影响较小，该分析方法可行。

1.7 单因素试验

考察乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比对竹叶香豆素得率的影响。

1.8 响应面优化

综合单因素的试验结果，进行四因素三水平的中心组合试验，用软件Design-Expert 8.0.1拟合响应值与影响因素的关系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹叶香豆素最佳工艺，将最佳工艺进行验证。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 总香豆素得率随乙醇体积分数的变化

由图1可知，当乙醇体积分数较小时，香豆素在溶液中的溶解度较小，所以提取出的香豆素量很少。当乙醇体积分数为50%时，总香豆素得率达到最大值（1.362 mg/g）。随乙醇体积分数继续升高，竹叶中有更多的物质被提取出来，对测量结果会造成干扰。

图1 总香豆素得率随乙醇体积分数的变化

2.1.2 总香豆素得率随液料比的变化

由图2可知，当液料比较小时，溶液黏度过大，不利于物料运动，使得香豆素溶出率低。当液料比为25︰1（mL·g-1）时，总香豆素得率有最大值（1.379 mg/g）。液料比继续增大，可能是由于溶液量过多，搅拌转速不够，造成物料在溶液中扩散速度较慢，所以香豆素提取率低。

图2 总香豆素得率随液料比的变化

2.1.3 总香豆素得率随提取时间的变化

由图3可知，提取40 min时，总香豆素得率有最大值（1.343 mg/g）。随提取时间增加，由于竹叶中香豆素含量少，香豆素全部被提取出来后，随着时间增长，被提取出来的黄酮浓度增大，计算香豆素得率时需要减去的值越大，所以香豆素得率在曲线上呈现出下降趋势。

2.1.4 总香豆素得率随提取温度的变化

由图4可知，在温度较低时，分子热运动较低，竹叶中香豆素溶出速率较慢。当提取温度升高到70 ℃时，总香豆素得率达到最大值（1.683 mg/g），温度继续升高会破坏香豆素分子的结构，所以溶液中香豆素含量减少。

图3 总香豆素得率随提取时间的变化

图4 总香豆素得率随提取温度的变化

2.2 响应面分析

2.2.1 试验因素水平设计（参见表1）

表1 试验因素水平表

2.2.2 建立模型及模型分析

以香豆素得率为因变量，A、B、C、D为自变量进行试验设计，见表2。将4种影响因素和总香豆素得率进行拟合并建模分析。回归方程（编码）为：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。

由表3可知，模型的p值=0.000 5＜0.05，说明模型有显著性，有统计学意义；失拟项p值=0.479 5＞0.05，没有显著性，说明方程的拟合性好，可信度高。

由图5可见，总香豆素得率随提取时间增加而上升，随乙醇体积分数增加，呈先升后降趋势；由图6可见，等高线图为椭圆形，说明液料比与提取温度交互影响非常显著，提取条件变化对总香豆素得率影响较大。当提取温度为65 ℃、液料比为27.5︰1（mL·g-1）时，总香豆素得率到达最大值；由图7可见，总香豆素得率随液料比升高而升高；随乙醇体积分数升高则呈现先增后降趋势；由图8可见，提取时间和提取温度间的交互对竹叶香豆素的提取率影响较大。

表2 试验设计及结果

表3 模型方程方差分析

2.2.3 验证最优工艺

对优化工艺（乙醇43.75%、提取温度80 ℃、液料比20︰1（mL·g-1）、提取时间50 min）进行验证，平行3次，最终总香豆素的平均得率为1.785 mg/g，与预测值1.870 mg/g的相对误差为4.5%。

图5 提取时间和乙醇体积分数对总香豆素得率的影响

图6 液料比和提取温度对总香豆素得率的影响

图7 液料比和乙醇体积分数对总香豆素得率的影响

图8 提取温度和提取时间对总香豆素得率的影响

3 结论与讨论

以毛竹叶为原料，在单因素试验基础上，采用多元二次回归方程拟合响应值与影响因素之间的函数关系，得到模型方程：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。通过建模分析，得出香豆素的最佳提取工艺：乙醇体积分数43.75%，提取温度80 ℃，提取时间50 min，液料比20︰1（mL·g-1）。验证试验的总香豆素得率为1.785 mg/g，与预测值1.870 mg/g的相对误差为4.54%，说明该模型拟合性较好，准确性较高，响应面法可用于优化竹叶香豆素提取工艺，且该方法简单可行。与提取样品溶液中香豆素含量0.868 mg/g比较，在此优化条件下进行提取，香豆素得率明显提高，为大规模提取竹叶香豆素奠定基础。试验毛竹中香豆素得率为1.785 mg/g与谢捷等[2]研究的毛竹中香豆素含量6.19 mg/g相比，含量较低，可能是采摘竹叶季节和地域因素不同，造成这种差异。

试验采用双波长法测定吸光度，进行香豆素定量，具有操作简单、快速的特点。但双波长法的特异性较差，试验样品溶液为混合溶液，样品溶液含有的其他物质会对测定结果造成干扰，所以在条件允许情况下，应采用更精确的方法进行试验，提高特异性。