热处理对鱼鳞蛋白酶解特性的影响

涂 丹 张益奇，2，3 林亚楠 叶 繁 戴志远，2，3*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310035 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310035 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连116000）

我国水产品资源丰富，据统计，2018年全国水产品总产量达6 457.66 万t[1]。水产品加工过程中会产生大量的鱼皮、鱼鳞、鱼骨等下脚料。其中，鱼鳞占到鱼体重的1%～5%，含有丰富的胶原蛋白，然而未得到很好的开发利用，造成极大的资源浪费和环境污染。

胶原蛋白通常具有天然的三股螺旋结构，其结构有很强的刚性，对蛋白酶有很强的抵抗力。目前，国内外对鱼源胶原蛋白资源的研究热度逐年增加，主要集中于鱼源胶原蛋白/明胶的提取及其性质研究[2-3]、酶解工艺优化[4]及其酶解产物的功能性质研究[5]等方面。前人研究发现适度热处理可使得蛋白质的刚性结构柔性化，从而形成利于提取或酶解的解离状态。如Yang 等[6-7]研究了高温条件下制备罗非鱼皮明胶水解液；Min 等[8]研究发现水热处理（150～250 ℃）可用于生产猪皮副产物蛋白质水解物；王彦蓉等[9]研究了高温处理下罗非鱼皮鱼鳞混合物的酶解特性；沙小梅等[10]采用高温水对鱼骨进行软化处理。相比于鱼皮，鱼鳞结构更为致密，其丰富的I 型胶原主要分布在鱼鳞内层，外层被羟基磷灰石覆盖，这些抗性屏障使得鱼鳞难以被降解，通常需要加大酶使用量（6%左右）[11-12]或采用分步酶解方式[13]制备胶原蛋白肽。为获得鱼鳞蛋白多肽，有必要对鱼鳞进行适当的热处理，探索其对鱼鳞蛋白溶出及酶解特性的影响。

本研究采用碱性蛋白酶水解罗非鱼鱼鳞蛋白，以蛋白质回收率、水解度、ACE 抑制率为指标，研究热处理温度、热处理时间以及底物浓度对鱼鳞蛋白酶解特性的影响，进一步探讨热处理条件对鱼鳞蛋白及其酶解产物的相对分子质量分布的影响。本研究旨在得到一种简单、高效的鱼鳞蛋白热预处理工艺，不仅能够减少环境污染，还可明显提高鱼类副产物资源酶解效率，产生良好的经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

罗非鱼鱼鳞（蛋白质含量55.87%），湛江环球水产有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 3L（酶活力为3.0 AU/g），诺维信公司；马尿酸（Hippuric acid，HA）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸 （N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管紧张素转换酶（Angiotensin Converting Enzyme from rabbit lung，ACE）、邻苯二甲醛（OPA）、抑肽酶、细胞色素C、碳酸酐酶、杆菌肽等均购于Sigma 公司。甲醇、乙腈（色谱纯）。

1.2 主要设备与仪器

400Y 多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；DGG-9123A 电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；DSHZ-300A 旋转式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；Fresco 21 冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher 公司；QL-8bb-253 旋涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；MLS-3781L 高压灭菌锅，日本Panasonic 公司；紫外分光光度计，美国ThermoFisher 公司；e2695 高效液相色谱，美国Waters 公司；K-360 凯氏定氮仪，K-425 快速消解仪，瑞士BUCHI 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼鳞前处理 将新鲜鱼鳞用清水冲洗，沥干，用0.1 N 氢氧化钠溶液浸泡12 h（料液比为1∶5），除去脂肪、杂蛋白等。用1% HCl 浸泡，料液比为1∶10，搅拌2 h 进行脱钙处理，流水冲洗3 h。

1.3.2 热处理单因素及酶解方法 热处理温度影响：配制质量分数1%鱼鳞溶液，分别在60，100，121，135℃条件下加热处理30min，冷却后进行酶解。

热处理时间影响：配制质量分数1%鱼鳞溶液，分别在121 ℃条件下加热处理0，15，30，60，90，120 min，冷却后进行酶解。

底物浓度影响：配制质量分数0.5%，1%，1.5%，2%，3%，4%鱼鳞溶液，在121 ℃条件下加热处理15 min，冷却后进行酶解。

酶解方法：热处理后冷却至55 ℃，加入碱性蛋白酶进行酶解。酶解条件如下：加酶量（E/S）0.1%、pH 8.0、温度55 ℃、反应时间120 min。反应结束后沸水浴10 min 灭酶，4 000 g 离心15 min，取上清液，即为鱼鳞蛋白酶解产物。

1.3.3 蛋白质回收率的计算 采用凯氏定氮法测定鱼鳞原料以及酶解前后上清液中的蛋白含量。

1.3.4 水解度的测定 样品的水解度测定采用OPA 法。根据D.Spellman 等[14]的方法适当修改。配制OPA 试剂：将7.620 g 四硼酸钠和200 mg SDS 用150 mL 去离子水溶解。完全溶解后加入4 mL 溶有160 mg OPA 的乙醇溶液，混匀后再加入176 mg DTT，定容至200 mL。该试剂对光敏感，需现用现配。

测定时，向加有3 mL OPA 试剂的试管中加入400 μL 样品（上清液按一定比例稀释所得），混匀，2 min 后测定其在340 nm 下的吸光度。并以纯水代替样品作为空白组。按同样的方法，以100 μg/mL 丝氨酸溶液代替样品作标准曲线，根据标准曲线计算上清液中游离氨基含量，进而计算水解度。

1.3.5 ACE 抑制率的测定ACE 抑制率根据Wu[15]的方法修改测定，采用高效液相色谱分析法。用0.1 moL/L 硼酸缓冲液 （pH=8.3，含有0.3 mol/L NaCI）配制反应底物HHL （6.5 mmoL/L）及ACE（100 U/L），取适量水解上清液稀释至40μL，与25 μL 的ACE 溶液混合于1.5 mL 聚乙烯离心管中，振荡器混匀，37 ℃下水浴保温10 min，加入40 μL的HHL 溶液启动反应，37 ℃下水浴保温30 min后，加入85 μL 1 mol/L 的HCl 溶液终止反应。0.45 μm 滤膜过滤后，通过HPLC 分析测定反应中产生的马尿酸（HA）的量。色谱条件：采用Waters2695HPLC 系统和UV/Vis 检测器，SunFireC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），上样量10 μL，检测波长228 nm，流动相为乙腈-0.1% TFA 水溶液（30∶70），流速为0.8 mL/min。ACE 抑制率的计算公式如下：

其中，A——用纯水代替酶解物参与反应条件下所产生的HA 的量；B——酶解物参与反应的条件下所产生的HA 的量。

1.3.6 相对分子质量分布测定 采用凝胶过滤层析法来测定相对分子质量分布情况。根据张燕萍等[16]方法修改。取反应上清液适量，0.45 μm 滤膜过滤后上样分析，色谱条件为：采用Waters2695HPLC 系统和UV/Vis 检测器，TSKgel G2000-SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh）色谱柱，检测波长220 nm，洗脱液为45%乙腈-55%水溶液（0.1% TFA），流速0.5 mL/min，进样量10 μL。相对分子质量校正曲线所用标准品为：HHL（429 u）、杆菌肽（1 422 u）、抑肽酶（6.5 ku）、细胞色素C（12.4 ku）、碳酸酐酶（29 ku）。

1.3.7 数据处理 试验数据用平均数±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS17.0 统计软件进行方差分析（ANOVA），用Duncan 多重比较法进行显著性检验（P＜0.05）。

2 结果分析

2.1 热处理对鱼鳞蛋白水解度及蛋白质回收率的影响

由图1a 可知，未经热处理时，鱼鳞蛋白蛋白质回收率和水解度分别为4.12%和0.2%，鱼鳞蛋白经不同高温处理30 min 后，蛋白回收率和水解度均有显著提高（P＜0.05）。当热处理温度由25 ℃升高到121 ℃时，蛋白质回收率和水解度增大到63.56%。进一步升高温度，蛋白质回收率变化不明显，但水解度进一步增大。由图1b 可知，蛋白回收率和水解度随处理时间的延长显著增大，其中0～15 min 处理二者均快速升高，后上升趋势变缓。这可能是由于高温破坏了鱼鳞蛋白分子间高级结构，胶原纤维间蛋白质分子链展开，促进鱼鳞明胶的溶出与水解。本研究在此基础上通过单因素试验进一步优化了不同热处理条件对鱼鳞蛋白酶解特性的影响。

图1 热处理温度（a）和时间（b）对蛋白质回收率和水解度的影响Fig.1 Effect of heat treatment temperature （a）and time （b）on the protein recovery and degree of hydrolysis

2.2 热处理对鱼鳞蛋白酶解特性的影响

2.2.1 不同处理温度对水解度及蛋白质回收率的影响 由图2可知，鱼鳞蛋白酶解产物蛋白回收率和水解度在25～121 ℃时随温度升高而快速上升，进一步提高温度，二者变化均不显著（P＞0.05）。这可能是因为热处理促进了鱼鳞明胶的溶出，同时使蛋白结构变得松散，暴露出更多的酶切位点，促进了蛋白酶的水解作用，从而使鱼鳞蛋白酶解产物蛋白质回收率和水解度增大。根据蛋白质回收率和水解度随处理温度的变化趋势，综合实际生产操作和成本问题，选取121 ℃为最佳的热处理温度，此时蛋白回收率和水解度都相对较高。

2.2.2 不同处理时间对水解度及蛋白质回收率的影响 由图3可知，高温处理后鱼鳞蛋白酶解产物蛋白质回收率和水解度显著升高 （P＜0.05），其中15 min 条件下其蛋白回收率为64.83%，较未热处理样品提高了75.31%，水解度是未热处理样品的两倍。当处理时间大于15 min 时，水解度变化不明显（P＞0.05），蛋白质回收率缓慢下降。由此可见，鱼鳞蛋白蛋白回收率并不会因热处理时间的延长继续升高，甚至在高温和蛋白酶的作用下还会降低。因此选取15 min 为最佳热处理时间。

图2 热处理温度对酶解产物蛋白质回收率和水解度的影响Fig.2 Effect of heat treatment temperature on the protein recovery and hydrolysis degree of enzymolysis product

图3 热处理时间对酶解产物蛋白回收率和水解度的影响Fig.3 Effect of heat treatment time on the protein recovery and degree of hydrolysis of enzymolysis product

2.2.3 不同底物浓度对水解度及蛋白质回收率的影响 在121 ℃、15 min 热处理条件下，不同底物浓度（0.5%～4%）鱼鳞蛋白酶解产物的蛋白回收率和水解度如图4所示。

由图4可知，当底物质量分数低于2%时，鱼鳞蛋白酶解产物的蛋白回收率和水解度变化不显著（P＞0.05），随着底物浓度的进一步增大，蛋白回收率和水解度均呈显著下降趋势（P＜0.05）。原因可能是底物浓度过高，整个反应体系过于黏稠，水的有效浓度降低，不利于热处理时蛋白的充分溶出，同时也使蛋白酶与底物蛋白酶切位点碰撞的几率变小，使得蛋白回收率和水解度下降[17-19]。综合考虑生产成本和实际操作问题，选择2%为最佳的底物浓度，此时蛋白回收率为65.93%，水解度为10.54%。

图4 底物浓度对酶解产物蛋白回收率和水解度的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on the protein recovery and degree of hydrolysis of enzymolysis product

通过上述单因素试验，获得热处理罗非鱼鱼鳞的较优条件为：热处理温度121 ℃，处理时间15 min，底物质量分数2%。

2.3 热处理对鱼鳞蛋白酶解产物ACE 抑制率的影响

由图5a 可看出，当热处理温度为25～121 ℃时，酶解产物ACE 抑制率随着处理温度升高而呈明显上升趋势，进一步增大处理温度，ACE 抑制率变化趋势不明显 （P>0.05）。从图5b 能看出，当121 ℃热处理15 min 时ACE 抑制率较未热处理样品有大幅度的提高，此时酶解液ACE 抑制率达73.80%，比未热处理组提高了66.78%，比传统热处理温度（60 ℃）提高了36.84%。随着热处理时间的延长，酶解液ACE 呈缓慢下降趋势。Bougatef等[20]研究沙丁鱼蛋白水解物时，以及Wu 等[21]研究用甜高粱籽粒生成ACE 抑制肽时都发现ACE 抑制率随水解度增大呈先升高后降低趋势。这可能是因为一定程度的热处理使蛋白质部分溶出，同时使蛋白质分子中含有丰富ACE 抑制肽段的疏水区域和三股螺旋结构舒展开，暴露出更多的酶切位点，更易于被酶切，水解度增大的同时释放出更多的ACE 抑制肽。随着水解度的不断增大，一些已经形成的ACE 抑制肽会在高温和蛋白酶的作用下被进一步水解为无活性的分子[22]，使得ACE 抑制率降低。

图5 热处理温度（a）和时间（b）对酶解产物ACE 抑制率的影响Fig.5 Effect of heat treatment temperature （a）and time （b）on the angiotensin converting enzyme inhibition rate of enzymolysis product

2.4 鱼鳞蛋白酶解产物相对分子质量分布

进一步测定了热处理（121 ℃、15 min）鱼鳞蛋白酶解前后上清液的相对分子质量分布。以各标准品保留时间 （t）为横坐标，分子质量的对数（lgM）为纵坐标作标准曲线。由标准曲线可知，分子质量的对数（lgM）与保留时间（t）呈良好的线性关系，回归方程为：lgM=-0.219t+7.192，决定系数R2=0.996。根据回归方程计算出样品相对分子质量在各范围的分布情况，结果如表1所示。

由表1可知，鱼鳞只经过热处理后，仍有90%以上为10 ku 以上的大分子，以及少量的1 ku 以下的小分子，说明热处理虽能有效促进蛋白溶出，并使蛋白结构变得松散，但热处理后的样品水解程度仍然较低。酶解后样品相对分子质量主要分布在5 ku 以下，其中1 ku 以下的小分子胶原肽占39.46%，这说明在热处理和蛋白酶的双重作用下，鱼鳞蛋白水解比较彻底。

表1 热处理罗非鱼鱼鳞酶解前后相对分子质量分布情况Table 1 The relative molecular mass distribution of the heat treated fish skin before and after enzymolysis

3 结语

本文对罗非鱼鱼鳞进行了不同条件的热处理，并以蛋白回收率和水解度为考察指标，综合生产成本和实际应用方面考虑，确定最佳的热处理条件为处理温度121 ℃、处理时间15 min，底物质量分数2%，在此条件下鱼鳞蛋白酶解产物蛋白回收率达65.93%，水解度为10.54%，比未热处理组分别提高了78.29%和89.23%，不同程度的热处理对酶解产物的降血压活性均有一定程度的增强作用，其中121 ℃、15 min 处理增强效果最佳，其ACE 抑制率为73.80%，比未热处理组提高了66.78%。经热处理的样品酶解前相对分子质量主要集中在10 ku 以上，酶解后样品主要集中在5 ku 以下，其中1 ku 以下的小分子高达39.46%。高温热处理作为一种鱼鳞蛋白酶解的物理性预处理方式，不仅简单高效、绿色环保，还能使鱼鳞变废为宝，减少环境污染，实现资源的合理利用，具有广阔的发展前景。