羟基红花黄色素A通过激活Kv通道舒张大鼠冠状动脉*

杨 蓉， 赵焕新， 季新燕， 翟晓艳， 杨李旺

(山西中医药大学基础医学院， 山西 太原 030024)

冠状动脉是给心脏提供血液供应的主要动脉，其正常的舒缩功能是保证心肌充足的供血供氧的前提。若冠状动脉过度收缩，则心肌供血供氧减少，就会诱发心绞痛、心肌梗死、甚至冠心病猝死等冠状动脉性疾病(又称缺血性心脏病)，舒张冠状动脉对防治心脏缺血性疾病具有重大意义。

血管平滑肌细胞是构成血管壁组织及维持血管张力的主要细胞成分，在心血管系统疾病的发生发展中扮演着重要角色。电压门控性钾通道(voltage-gated K+channels，Kv channels)是维持血管平滑肌细胞正常膜电位和肌张力的重要通道[1-2]。

红花为传统的活血化瘀类中药,红花黄色素是从红花中提取的水溶性活性成分，为红花的主要药效成分，属于黄酮类化合物。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是红花黄色素结构已经明确的有效单体成分，分子式为C27H32O16，属小分子查尔酮葡萄糖苷类物质。近年来对HSYA舒张血管作用研究颇多，对其舒张机制也进行了初步探讨[3-6]，但HSYA对大鼠冠状动脉(rat coronary artery,RCA)的舒张作用及其与Kv通道的关系却未见报道。

本研究拟采用 DMT 离体血管环技术明确HSYA对RCA的肌源性反应；采用全细胞膜片钳技术观察HSYA对 RCA平滑肌细胞Kv电流的影响；采用Western blot技术探讨HSYA对RCA平滑肌细胞 Kv1.2和 Kv1.5通道蛋白表达的影响，为HSYA防治心脏缺血性疾病提供药理学理论依据。

材 料 和 方 法

1 动物

正常成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重 220～240 g，购自山西医科大学实验动物中心，动物许可证号为SCXK(晋)2017-0001。

2 主要试剂

羟基红花黄色素 A(Q-008-170303)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度>98%；U46619、二硫丁四醇、木瓜蛋白酶、白蛋白、胶原蛋白F和胶原蛋白H购自Sigma；兔源Kv1.2和Kv1.5抗体购自Alomone Labs；其余试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

3 实验仪器

Multi Myograph System-610离体微血管环张力记录仪(DMT)；膜片钳放大器(Axon)；垂直电泳系统(Bio-Rad)。

4 实验方法

4.1RCA血管环的制备 大鼠麻醉后取心脏置于预冷(4 ℃)、pH 7.4且氧饱和的生理盐溶液中，分离冠状动脉，制备冠脉血管环，将其固定于DMT微血管环张力记录仪上。依据文献方法[7]，用60 mmol/L KCl收缩RCA，当收缩幅度大于2 mN时，认为血管环反应性良好，可用于后续正式实验。

4.2HSYA对预收缩RCA血管环的舒张作用 向DMT浴槽中分别加入60 mmol/L KCl或0.1 mmol/L U46619，待血管收缩达坪台时，再向浴槽中累积加入3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L的HSYA，观察HSYA对预收缩RCA血管环的舒张作用。

4.3内皮对HSYA舒张U46619 预收缩RCA血管环作用的影响 用比冠状动脉内径稍细的金属丝轻轻穿过血管环，反复2～3次，机械性去除冠脉血管内皮[8]。依据文献方法[9]，用60 mmol/L KCl收缩去内皮的RCA血管环，当收缩达坪台时，加入1 μmol/L 乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)舒张血管，若舒张百分比不足60 mmol/L KCl收缩幅度的40%，则认为内皮去除。在内皮完整组和去内皮组分别加入0.1 mmol/L U46619，待血管收缩达坪台时，再向浴槽中累积加入上述浓度的HSYA，观察内皮对HSYA舒张预收缩(0.1 mmol/L U46619)冠脉血管环作用的影响。

4.4HSYA对RCA平滑肌细胞Kv电流的影响 参照文献[7]，在37 ℃恒温且氧饱和条件下，将分离出的RCA放入细胞酶解液Ⅰ(细胞分离液中加入0.5 g/L木瓜蛋白酶、1 g/L白蛋白和1 g/L二硫丁四醇)中，孵育20 min，之后将其转移至细胞酶解液Ⅱ(细胞分离液中加入1 g/L白蛋白、0.5 g/L胶原蛋白F和0.5 g/L胶原蛋白H)中，孵育10 min后，用滴管轻轻吹打RCA血管环，使平滑肌细胞从血管环骨架上脱落下来。用连续电压刺激(-60 mV～+60 mV，步阶10 mV)RCA平滑肌细胞，以全细胞膜片钳方式记录不同浓度的HSYA对RCA平滑肌细胞Kv电流的影响，用细胞的电容标化其电流，实验结果用电流密度(pA/pF)表示。

4.5HSYA对RCA平滑肌细胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表达的影响 参照文献[7]将收集的去内皮的冠状动脉分组孵育不同浓度的HSYA，8 h 后取出各组血管环，液氮速冻后，-80 ℃保存。加RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。等量各组总蛋白经SDS-PAGE后电转移至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。根据目的蛋白的分子量，以Marker为参照，将NC膜裁剪至合适大小后置于Kv1.2 (1∶400)和Kv1.5 (1∶400) I抗中，4 ℃孵育过夜。之后，将NC膜放入辣根酶标记的 II 抗中，孵育60 min。目的蛋白以 GAPDH 为内参照，ECL化学发光显色，在Bio-Rad凝胶成像仪中成像并拍照，结果采用ImageJ软件进行分析。

5 统计学处理

采用 SPSS 23.0 对数据进行统计分析。实验结果均以均数±标准差(mean±SD)表示，两样本间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 8 制作统计图。

结 果

1 HSYA对预收缩RCA血管环的舒张作用

60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619收缩RCA血管环的幅度分别为(3.57±0.12) mN和(3.76±0.19) mN。10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可显著舒张预收缩的冠脉血管环(P<0.05)，使60 mmol/L KCl预收缩的冠脉血管环收缩幅度分别降低至(3.27±0.20) mN和(2.94±0.17) mN，使0.1 mmol/L U46619预收缩的冠脉血管环收缩幅度分别降低至(3.47±0.16) mN和(3.03±0.17) mN，见图1。

Figure 1.HSYA-induced vasorelaxation in KCl- and U46619-precontracted RCA rings. Means ±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1 HSYA对KCl和 U46619预收缩大鼠冠脉血管环的舒张作用

2 内皮对HSYA舒张U46619预收缩RCA血管环作用的影响

内皮完整组与去内皮组HSYA舒张U46619(0.1 mmol/L)预收缩RCA血管环的作用的差异无统计学显著性(P>0. 05)，见图2。

Figure 2.HSYA-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded (End-) RCA rings precontracted with U46619. Means±SD.n=6.

图2 HSYA对U46619 预收缩的内皮完整组和去内皮组RCA血管环的影响

3 HSYA对RCA平滑肌细胞Kv电流的影响

在测试电压为+60 mV 时，RCA平滑肌细胞正常Kv电流密度为(43.74±6.09) pA/pF。HSYA可浓度依赖性增加Kv电流密度，3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L HSYA分别使Kv电流密度增加至(51.26±4.77) pA/pF、(67.81±5.08) pA/pF和(80.67±5.96) pA/pF，以上差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

4 HSYA对RCA平滑肌细胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表达的影响

与control组比较，10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可使RCA平滑肌细胞Kv1.2通道蛋白表达显著增加(P<0.05)，增加的百分率分别为(30.91±6.88)%和(39.18±7.11)%；HSYA(10 μmol/L和30 μmol/L)也可使Kv1.5通道蛋白表达分别显著增加(28.16±5.87)%和(40.31±6.87)%(P<0.05)，见图4。

讨 论

目前大量研究已肯定了HSYA对心血管系统的药理作用，HSYA可以抗心肌缺血[10]、抗氧化[11]、调节血管内皮细胞[12]、舒张大鼠主动脉[6]和猪冠状动脉[4]。本实验结果显示，HSYA对KCl和U46619预收缩的RCA有显著舒张作用，但其对U46619预收缩的内皮完整组和去内皮组RCA舒张作用无统计学差异，说明HSYA舒张RCA的作用与内皮无明显关系。

Figure 3.The effect of HSYA on Kv currents in freshly isolated RCA smooth muscle cells. A: original recordings of the outward currents evoked by a series of depolarizing pulses (from -60 mV to +60 mV in 10-mV increments for 500 ms duration) in the absence (control) or presence of HSYA (3 μmol/L, 10 μmol/L and 30 μmol/L); B: the current-voltage curves. Means±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3 HSYA对RCA平滑肌细胞Kv电流的影响

Figure 4.The effect of HSYA on the protein expression of Kv1.2 (A) and Kv1.5 (B) in the RCA smooth muscle cells. Means±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

图4 HSYA对RCA平滑肌细胞Kv1.2和Kv1.5蛋白表达的影响

血管平滑肌细胞上分布有多种离子通道，钾离子通道主要包括4种：Kv、钙依赖性的钾通道(Ca2+-dependent potassium channel，KCa)、ATP敏感的钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)和内向整流钾通道(inwardly-rectifying potassium channel，KIR)，其中Kv通道在维持细胞正常膜电位和调节冠状动脉血流方面起着至关重要的作用[1, 13]。全细胞膜片钳实验结果表明，HSYA可浓度依赖性增加RCA平滑肌细胞Kv电流，说明经由Kv通道促进K+外流是HSYA舒张RCA的关键因素。

到目前为止，已经明确的Kv通道已有12个家族、40多种亚型[14]，在动脉平滑肌细胞上Kv1.2和Kv1.5通道发挥重要作用[15]。为了进一步明确HSYA舒张RCA平滑肌的机制，及参与此作用的Kv通道亚型，我们采用Western blot法观察了HSYA对RCA平滑肌上Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表达的影响。实验结果表明，HSYA可以使RCA平滑肌细胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表达显著增加，从而在分子层面证实HSYA舒张RCA与Kv通道有关，同时提示Kv1.2和Kv1.5通道参与了HSYA对RCA的舒张作用。

综上所述，本实验结果表明HSYA可舒张预收缩的RCA，该作用与血管内皮无关，其可能的机制是通过增强Kv通道功能和蛋白表达而舒张 RCA。本研究结果为临床使用HSYA防治心脏缺血性疾病提供理论依据。