AT1-AA通过氧化应激诱导心肌H9c2细胞自噬及凋亡

岳继萍， 王 瑾， 张文婷， 张志楠， 靳文文， 焦向英

(山西医科大学生理学教研室， 山西 太原 030001)

《中国心血管病报告2018》指出，未来十年我国心血管疾病患病人数仍加速增长，尽管针对目前已知原因所采取的治疗效果显著，但心血管病死亡率仍高占居民总死亡原因首位[1]，提示还有一些未知因素参与心血管疾病的发生发展。近年来，人们在心血管类疾病如高血压性心脏病、冠心病和心衰等患者血清中均检测到血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)，且其AT1-AA阳性率和滴度都明显高于正常人[2-4]。有研究表明AT1-AA可以直接诱导心肌细胞凋亡[5]，提示 AT1-AA 参与心血管疾病的发生发展。但是，其诱导心肌细胞凋亡的机制尚不清楚。

研究表明自噬(autophagy)与心脑血管等疾病关系密切。自噬是一种受调控的程序性死亡，是细胞内降解衰老蛋白、受损胞质的过程[6]。生理情况下自噬水平较低；机体应激时，自噬被激活,为机体提供能量并维持细胞稳态[7-8];而刺激持续存在时，过度激活的自噬会损伤细胞[9]。AT1-AA具有类血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)的激动样作用，Ang Ⅱ可以激活自噬，那么AT1-AA是否也可激活自噬？是否可以诱导心肌细胞凋亡？

研究表明，氧化应激可以导致细胞自噬及心功能异常[10-11]，抑制氧化应激可以阻止细胞的进一步损伤。AT1-AA可以诱导氧化应激[12]，而AT1-AA诱导的氧化应激与其诱导的自噬、凋亡之间是否有关有待验证。

材 料 和 方 法

1 材料

H9c2细胞购自中国医学科学院协和细胞库。DMEM培养基购自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Cell Max；0.25%胰酶购自索莱宝科技有限公司；血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1-R)抑制剂替米沙坦(telmisartan, TM)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和氧化应激抑制剂α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)购自Sigma；CCK-8检测试剂盒、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、凝胶配制试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和超敏ECL化学发光试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒均购自南京建成公司；LC3抗体、Beclin1抗体、p62抗体、caspase-3抗体和β-actin抗体购自CST。

2 主要方法

2.1细胞培养与分组 将心肌H9c2细胞分为阴性对照(negative IgG)组、AT1-AA处理组、AT1-AA+3-MA处理组、AT1-AA+α-LA处理组和AT1-AA+TM处理组。

2.2AT1-AA的提纯 用生物合成的血管紧张素Ⅱ 1型受体胞外第二环抗原肽段AT1R-ECⅡ(序列为：165～191，IHRNVFFIENTNITVCAFHYESQNSTL)主动免疫SD大鼠8周，IgGs亲和纯化提纯AT1-AA，酶标仪检测其浓度。

2.3CCK-8法检测细胞活力 收集对数期细胞加入96孔板中，细胞贴壁后将培养基吸掉，换加含有不同梯度浓度的AT1-AA培养基分别作用12、24、36和48 h，避光加入10 μL CCK-8液，细胞孵育箱内继续孵育2 h，酶标仪450 nm处测定吸光度(A)值，按照公式[细胞相对活力(%)=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%]计算。

2.4Western blot检测蛋白水平 分别检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的表达以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平。收集细胞，加入80 μL RIPA裂解液和1 μL的PMSF吹散细胞，超声碎裂1 h，12 000 r/min 离心15 min，取上清。BCA法测细胞浓度做SDS-PAGE，转膜，封闭，孵育 I 抗和 Ⅱ 抗，ECL发光液进行曝光。曝光条带用ImageJ软件做灰度值分析，用β-actin作内参照。

2.5氧化应激指标的检测 收集对数期细胞，碎裂细胞，12 000 r/min离心15 min取上清。据氧化应激指标GSH-Px、SOD和MDA试剂盒说明书进行操作，检测相关数据。

3 统计学处理

用SPSS 24.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示，多组均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AT1-AA引起H9c2细胞活力下降，凋亡增加

与negative IgG组相比，随着AT1-AA浓度的升高，H9c2细胞的活力逐渐下降，在10-5mol/L时下降显著(P<0.01)，见图1A；10-5mol/L的AT1-AA分别孵育H9c2细胞不同时长(12 h、24 h、36 h和48 h)，与negative IgG相比，AT1-AA处理细胞24 h～48 h,细胞活力均显著下降(P<0.01)，见图1A。以上结果提示AT1-AA可浓度和时间依赖性的降低心肌H9c2细胞的活力。10-5mol/L的AT1-AA处理H9c2细胞24 h，Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平,结果显示，与negative IgG组相比，AT1-AA组H9c2细胞的cleaved caspase-3水平上升(P<0.01)，见图1B,提示AT1-AA可以诱导心肌H9c2细胞凋亡。

Figure 1.The changes of the viability (A) and the expression of cleaved caspase-3 (B) in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsnegative IgG group.

图1 AT1-AA诱导的H9c2细胞的存活率及caspase-3的表达变化

2 AT1-AA诱导心肌H9c2细胞自噬增加

10-5mol/L AT1-AA处理细胞24 h后，Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的蛋白水平，结果显示，与negative IgG组相比，AT1-AA组H9c2细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的水平增加(P<0.01)，而p62蛋白的水平则降低(P<0.01)，见图2。这提示AT1-AA可以诱导心肌H9c2细胞自噬。

3 自噬抑制剂3-MA抑制AT1-AA诱导的H9c2细胞凋亡

10-5mol/L的3-MA预处理细胞1 h后，再加AT1-AA(10-5mol/L)处理细胞24 h。用Western blot检测自噬相关蛋白的表达水平,结果显示,与AT1-AA组相比，AT1-AA+3-MA组的H9c2细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的表达水平下降(P<0.05)，而p62蛋白的表达上调(P<0.05)，见图3A，提示AT1-AA诱导的自噬被抑制。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，结果显示,与AT1-AA组相比，AT1-AA+3-MA组细胞的cleaved caspase-3/caspase-3水平下降(P<0.05)，见图3B。以上结果提示抑制自噬可抑制AT1-AA诱导的H9c2细胞凋亡。

4 AT1-AA激活H9c2细胞的氧化应激

10-5mol/L的AT1-AA处理细胞24 h，收集细胞用氧化应激试剂盒检测GSH-Px、MDA和SOD的水平，发现AT1-AA组的GSH-Px和SOD高于negative IgG组，MDA低于negative IgG组(P<0.05)，见表1。

5 氧化应激抑制剂α-LA降低AT1-AA诱导的H9c2细胞的自噬和凋亡水平

10-4mol/L α-LA预处理H9c2细胞12 h，再加AT1-AA(10-5mol/L)处理细胞24 h后收集细胞。氧化应激试剂盒检测GSH-Px、MDA和SOD的水平发现，与AT1-AA组相比，AT1-AA+α-LA组细胞的GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高(P<0.05),见表1。Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的水平，结果显示，与AT1-AA组相比，AT1-AA+α-LA组H9c2细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表达减少(P<0.05)，而p62蛋白表达则上升(P<0.05)，见图4A。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，结果显示,与AT1-AA组相比，AT1-AA+α-LA组细胞的cleaved caspase-3水平下降(P<0.05)，见图4B。以上结果提示氧化应激抑制剂α-LA可以抑制AT1-AA诱导的心肌H9c2细胞的自噬和凋亡。

Figure 2.The autophagy of H9c2 cells was induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsnegative IgG group.

图2 AT1-AA诱导H9c2心肌细胞的自噬增加

Figure 3.Autophagy inhibitor 3-MA reduced the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

图3 自噬抑制剂3-MA抑制AT1-AA诱导的H9c2细胞的自噬和凋亡的水平

表1 氧化应激水平的变化

Table 1.The levels of GSH-Px, MDA and SOD (Mean±SEM.n=10).

Group GSH-Px(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Negative IgG23.077±8.5710.507±0.20526.973±8.091 AT1-AA110.110±7.253*0.127±0.037*57.499±10.356*AT1-AA+α-LA61.319±9.890#0.261±0.084#44.575±6.556# AT1-AA+TM40.879±7.912#0.285±0.101#34.547±5.622#

*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

6 AT1-R抑制剂TM降低AT1-AA诱导的H9c2细胞氧化应激、自噬和凋亡水平

10-6mol/L的TM预处理细胞1 h，AT1-AA+TM再处理H9c2细胞24 h后收集细胞。氧化应激试剂盒分别检测GSH-Px、MDA和SOD的水平发现，与AT1-AA组相比，AT1-AA+TM组的GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高(P<0.05)，见表1。Western blot检测LC3、Beclin1和p62的蛋白水平,结果显示与AT1-AA组相比，AT1-AA+TM组H9c2细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表达减少(P<0.05)，而p62蛋白表达则增加(P<0.05)，见图5A。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平，结果显示,与AT1-AA组相比，AT1-AA+TM组细胞的cleaved caspase-3水平下降(P<0.05)，见图5B。以上结果提示AT1-R抑制剂TM可以降低AT1-AA诱导的心肌H9c2细胞的氧化应激、自噬和凋亡水平。

Figure 4.Oxidative stress inhibitor α-LA reduced the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

图4 氧化应激抑制剂α-LA降低AT1-AA诱导的H9c2细胞的自噬和凋亡水平

Figure 5.Telmisartan (TM) attenuated the protein levels of autophagy (A)- and apoptosis (B)- associated molecules in the H9c2 cells induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsnegative IgG group;#P<0.05vsAT1-AA group.

图5 替米沙坦降低AT1-AA诱导的H9c2细胞的自噬和凋亡水平

讨 论

本研究首先用CCK-8法检测了AT1-AA可以浓度及时间依赖性降低H9c2细胞的活力；与negative IgG组相比，Western blot法检测显示AT1-AA组凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3的水平上升，提示AT1-AA可以导致心肌H9c2细胞活力下降,凋亡增加。而AT1-AA诱导细胞凋亡的机制不清。

自噬是溶酶体降解并清除受损细胞器的过程。通过平衡细胞合成和分解，自噬可以稳定细胞内环境。然而, 过度自噬可致细胞发生Ⅱ型程序性细胞死亡。自噬的程度可用LC3-Ⅱ/LC3-I比值评价，随着自噬发生，LC3-Ⅱ蛋白逐渐增加[13]。在自噬溶酶体降解过程中，p62受体作为底物结合物被降解清除，而当自噬受阻，p62蛋白的表达水平则显著上调[14]。Beclin1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，可以调节自噬活性[15]。本研究通过用Western blot法检测自噬相关蛋白发现，AT1-AA促进LC3-Ⅱ/LC3-I和Beclin1的表达，而抑制p62蛋白的表达，表明AT1-AA可以激活自噬；为了进一步探讨自噬对AT1-AA诱导细胞凋亡的影响，我们用自噬抑制剂3-MA预处理细胞，发现AT1-AA对细胞的促凋亡作用被抑制。这说明自噬参与AT1-AA诱导H9c2细胞的凋亡过程。

氧化应激时细胞可通过自噬降解受损细胞器和长寿命蛋白质[16]。研究表明，自噬与氧化应激共同参与许多心脏疾病的发生发展，探讨自噬与氧化应激的可能关系有望成为心脏疾病的治疗新靶点[17-18]。研究表明AT1-AA可以激活氧化应激[19]，与本研究的结果一致。而加入氧化应激抑制剂α-LA处理H9c2细胞发现，AT1-AA诱导的氧化应激被抑制，自噬和凋亡水平也有所下降，提示氧化应激位于自噬和凋亡的上游且调控AT1-AA诱导的自噬和凋亡过程。

研究表明，AT1-AA可以通过专一识别、结合AT1-R受体来发挥类血管紧张素Ⅱ的激动样作用且其对AT1-R的刺激作用不易脱敏[2， 20]。因此为了进一步验证AT1-R是否参与了AT1-AA诱导的氧化应激、自噬和凋亡，我们采用AT1-R抑制剂TM预处理细胞，结果表明AT1-AA诱导的氧化应激、自噬和凋亡水平明显降低，提示AT1-AA通过AT1-R影响H9c2细胞的氧化应激、自噬和凋亡。

综上所述，AT1-AA可以通过AT1-R激活氧化应激而上调自噬，进而导致心肌细胞的凋亡增加。