中国南方汉族人群ZCCHC14基因多态性与小动脉闭塞性卒中的关系☆

李建立 江东东 刘柳余 蒋怡颖 罗曼△※

缺血性脑卒中 (ischemic stroke,IS)的发病机制尚未完全清楚。但大量病因学研究已经表明，IS的发生是一个多步骤、多阶段的复杂过程，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。根据当前国际普遍使用TOAST分型[1]，IS分为大动脉粥样硬化（large artery atherosclerosis,LAA）型、心源性脑栓塞 （cardio embolism,CE）型、小动脉闭塞（small artery occlusion,SAO）型、其他明确原因型和不明原因型。SAO约占所有IS的四分之一[2]，其发病机制尚未明确。流行病学数据表明遗传因素在SAO的发病中发挥着重要作用[3]，最近一项全基因组关联研究 （genome wide association study,GWAS）发现[4]，包含CCHC结构域的锌指蛋白14（zinc finger CCHC domain-containing 14,ZCCHC14）基因单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism,SNP）rs12445022与SAO相关，该研究主要针对欧洲人群，目前尚无ZCCHC14基因与中国人群SAO相关性的研究报告。因此，本研究以中国汉族SAO患者及健康人群作为研究对象进行病例对照研究，以确定SNP rs12445022与中国汉族人群SAO之间的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2016年9月至2017年12月就诊于广西医科大学第一附属医院神经科的SAO患者121例作为研究对象。纳入标准:① 年龄>18岁；② 中国南方地区无亲缘关系的常住汉族居民，3代及以上直系亲属内无其他民族；③ 诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》中IS诊断标准[5]，所有病例经CT和/或 MRI确诊；④ 临床表现为腔隙综合征，梗死面积最大直径＜1.5 cm。排除标准：①心源性脑栓塞；②同侧颅内、外大动脉狭窄>50%；③其他已知病因及原因不明性IS；④其他类型的脑血管疾病，包括颅内出血、蛛网膜下腔出血、短暂性脑缺血发作、脑血管畸形、动脉瘤等；⑤ 既往有神经系统疾病或脑外伤病史；⑥严重心、肝、肾功能不全，血液病，自身免疫性疾病以及肿瘤患者。对照组纳入标准：①年龄和性别匹配；②中国南方地区汉族居民。排除标准：①患有脑血管病及神经系统疾病；② 患有内分泌及代谢性疾病(除外糖尿病)，严重心、肝、肾功能不全，血液病，自身免疫性疾病以及肿瘤患者。本研究获得伦理委员会批准，所有患者充分知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 病例组于入院当天，对照组于体检当天取外周静脉血2 mL，EDTA抗凝。使用全血基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司)提取基因组DNA。

1.2.2 基因分型方法 ① PCR扩增:引物使用Primer 3.0软件设计,上游引物序列:5′-ACTGTCCCCCTTGGAACCTCTC-3′，下游引物序列:5′-AAGCCAATGAAAGCGGACACAT-3′,PCR 反应体系(20 μL)包含：1×GC 缓冲液 I，3.0 mmol/L 氯化镁，0.3 mmol/L dNTP，1UHotStarTaq 聚合酶，1 μL 样本 DNA 和 2 μL多重 PCR 引物 (2 μmol/L)。PCR反应条件：95℃预变性 2 min；94℃变性 20 s，65℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，11 个循环；94℃变性20 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，24 个循环；最后72℃延伸2 min。PCR产物4℃保存。② SNP基因分型：取PCR产物 15 μL，依次加入 SAP酶5 U、外切酶2 U，37℃温浴1 h，然后 75℃灭活15min。继而进行SNaPshot多重单碱基延伸反应延伸。延伸引物序列：5′-TTTTTTGCCAGAGCGGGGTAAGGGTT-3′，引物由上海生物工程公司合成。反应体系包括：SNaPshot Multiplex Kit(ABI)5 μL，纯化后多重 PCR 产物 2 μL，延伸引物 1 μL，超纯水 2 μL。反应条件：96℃预变性 1 min；96℃变性10 s，52℃退火 5 s，60℃延伸 30 s，28 个循环；4℃保存。在10 μL延伸产物中继续加入SAP酶1 U，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min，以纯化延伸产物。取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD、9 μL Hi-Di混匀，变性后在ABI3730XL测序仪上样，用GeneMapper 4.1分析检出 AA、GA、GG三种基因型。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量资料用（±s）表示。计量资料的组间差异比较先行正态性检验和方差齐性检验，正态分布采用t检验或近似t检验;非正态分布采用Mann-Whitney U检验。计数资料的比较及Hardy-Weinberg平衡检验采用检验。采用单因素非条件logistic回归计算OR和95%CI，采用多因素非条件logistic回归分析对混杂因素进行校正。所有检验均为双侧，检验水准α=0.05。

表1 SAO病例组与正常对照组临床资料的比较

2 结果

2.1 SAO组和对照组临床资料比较 见表1。病例组与对照组相比较，年龄、性别、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、冠心病史等差异均无统计学意义(P＞0.05)。而高血压史、糖尿病史、吸烟史均差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 SAO病例组及对照组rs12445022位点基因型观察值与期望值检测均符合HWE平衡法则 （SAO病例组=1.504，P=0.220；正常对照组=2.684，P=0.101），表明两组样本均具有群体代表性。

2.3 SAO组和对照组基因型及等位基因分布情况两组 ZCCHC14基因 rs12445022位点 AA、GA、GG基因型及A、G等位基因分布比较见表2。SAO组与对照组相比，AA、GA、GG基因型分布 (=2.931、P=0.223)及 A、G 等位基因分布(=3.041、P=0.081)均无统计学意义。

2.4 不同遗传模型下SNP rs12445022多态性与SAO发病风险的关系 为调整多重因素对SAO的影响，以SAO作为因变量，以高血压史、糖尿病史、吸烟史、LDL-C等作为混杂因素予以校正，进行非条件logistic回归分析。遗传模型包括显性(AA+GA vs.GG)、隐性(AA vs.GA+GG)和加性(AA vs.GG)模型。结果显示：在三种遗传模型下，ZCCHC14基因SNP rs12445022多态性与SAO均无相关性 (P>0.05)。经过校正上述混杂因素后，在显性模型下，SNP rs12445022多态性与SAO相关(校正 OR=2.12,95%CI:1.02～4.40,P=0.044，表3)，提示SNP rs12445022非GG基因型会增加SAO的发病风险，非GG基因型携带者(AA+GA)的发病风险是GG基因型携带者(GG)的2.12倍。

3 讨论

自2003年[6]以来，已有许多项独立的GWAS对IS易感基因多态性进行了探索，并确定了一些与IS发病风险相关的SNP位点，进一步病因学亚型分析发现，这些SNP多与LAA、CE亚型相关，鲜有SNP被发现与SAO相关。直至2017年，TRAYLOR等[4]对欧洲IS人群及正常对照进行了大样本的GWAS研究，结果发现ZCCHC14基因rs12445022与SAO相关。紧接着该研究又进一步进行了功能研究，结果显示rs12445022 A等位基因与动脉组织中ZCCHC14 mRNA表达下降有关，还和血液CpG岛甲基化水平降低有关，因此推测危险等位基因是通过降低ZCCHC14的表达进而影响CpG岛甲基化水平来介导SAO发生的[4]。

表2 SAO组和对照组rs12445022位点基因型及等位基因分布

表3 不同遗传模型下SNP rs12445022与SAO的相关性分析

ZCCHC基因编码一类含有CCHC结构的锌指蛋白，后者已被证明具备DNA、RNA、蛋白质结合活性，在细胞分化、胚胎发育、生殖细胞形成、神经系统形成等众多过程发挥重要作用。到目前为止，针对ZCCHC基因的功能研究较少，其功能可能与转录以及转录后基因调控有关。ZCCHC14基因位于人类第16号染色体上，由约8万多个碱基包括14个外显子及5个转录本。ZCCHC14基因曾被发现与小头畸形[7]、尼古丁成瘾、酒精成瘾[8]和食物成瘾[9]相关。然而，上述研究并未能阐明ZCCHC14的功能，ZCCHC14通过何种信号通路发挥作用也不清楚。

继2017年针对欧洲人群的GWAS研究[4]之后，2018年MALIK等[10]对多种族来源（包括欧洲、东亚、南亚、混合亚洲、非洲和拉丁美洲）的GWAS研究进行了跨祖先荟萃分析，结果再次证实ZCCHC14基因rs12445022与SAO相关，但该研究所纳入的亚洲人群的种族、国籍构成不详。我们以中国南方汉族SAO患者及健康人群作为研究对象进行了病例对照研究，结果显示SAO患者具有更高的高血压史、糖尿病史及吸烟史，这与既往的研究[11-13]相符。关联研究结果显示，经高血压史、糖尿病史、吸烟史、LDL-C等多因素校正后，ZCCHC14基因SNP rs12445022多态性与SAO相关（显性模型：校正OR=2.12,95%CI:1.02-4.40,P=0.044），提示非GG基因型会增加SAO的发病风险，非GG基因型携带者（AA+GA）的发病风险是GG基因型携带者（GG）的2.12倍。虽然SNP rs12445022位点基因型及等位基因分布未显示统计学差异，但由于病例对照设计本身受混杂因素的影响，所以需要校正对结局有影响的混杂因素，结果以多因素校正后的结果为准，即ZCCHC14基因SNP rs12445022与中国汉族人群SAO相关。

综上所述，本研究结果显示ZCCHC14基因SNP rs12445022多态性与中国南方汉族人群SAO发病风险有关。但是，鉴于本研究的样本量较小以及民族、地域等客观因素的局限性，因此在今后的研究中需要进一步扩大样本量，并选择中国多个地区及民族进行研究证实。