Nrf2蛋白在中波紫外线照射HaCaT细胞中的光保护作用

林芳 马良娟 张晓卉 柏冰雪

哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科 150000

林芳现在沧州市中心医院皮肤科，河北 061000

紫外线照射是急性皮肤光损伤、慢性光老化和光致癌作用的主要致病因素。中波紫外线（UVB）照射是造成皮肤光损伤的主要原因［1］。UVB主要作用于表皮角质形成细胞，产生氧化应激反应，并诱发机体皮肤炎症，从而造成角质形成细胞氧化损伤［2］。核转录因子红系2相关因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor-2，Nrf2）是一种抗氧化反应的主要调节因子［3］，在氧化应激状态下与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合成为Nrf2/ARE通路，可以清除体内活性氧，抑制炎症，保护细胞免受氧化应激损伤。据报道，一些具有光保护作用的物质能够通过激活Nrf2及Nrf2/ARE通路减轻氧化应激反应，延缓光损伤［4-5］。我们建立UVB光损伤的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，并对HaCaT细胞感染Nrf2增强基因慢病毒，增强细胞内Nrf2蛋白的表达，在细胞水平上研究Nrf2在皮肤角质形成细胞光损伤中的保护作用。

材料与方法

一、材料与仪器

Nrf2增强基因慢病毒（上海汉恒生物公司）。人永生化角质形成细胞（HaCaT）由哈尔滨医科大学附属第二医院实验室提供。DMEM细胞培养液、胎牛血清、CCK8细胞增殖毒性检测试剂盒（日本同仁化学研究所），DHE超氧化物阴离子荧光探针（上海碧云天公司），超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），人肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）ELISA 测定试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），Nrf2兔抗人抗体、β肌动蛋白抗体、辣根酶标记的山羊抗兔Nrf2抗体（上海碧云天公司），UVB灯管（南京华强电子有限公司）、电泳仪、iMark酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

二、方法

1.细胞培养与分组：复苏HaCaT细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%CO2下培养，每1～2 d换液，取3～5代HaCaT细胞，分为对照组（不转染，不照射）、UVB组（不转染，照射）、Nrf2组（转染，不照射）、Nrf2+UVB组（转染，照射）。本文所有实验均重复3次。

图1 倒置荧光显微镜下HaCaT细胞转染带有荧光标记的Nrf2增强基因后的荧光情况（×200） 4组细胞的转染效率分别为10%、50%、70%、90%

2.Nrf2增强基因慢病毒转染预实验：取3～5代HaCaT细胞，于96孔培养板中每孔接种3 000～5 000个细胞，加入100 μl培养基，培养箱过夜。细胞分为4组，用不含胎牛血清的完全培养基培养24 h。稀释病毒原液转染细胞，每组细胞的感染复数（MOI，multiply of infection）值（指每个细胞感染的病毒数）分别设为10、20、50、100，转染后培养12 h，观察细胞状态，无明显异常时，继续培养24 h，更换培养基，转染48 h时，观察转染效率。该慢病毒带有绿色荧光蛋白报告基因，可通过荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达效率，得到细胞转染效率。结果显示，MOI值为20时，细胞转染效率约为50%，实验可行性及经济价值最合适。

3.感染Nrf2增强基因慢病毒及UVB照射：取3～5代HaCaT细胞，根据预实验条件，进行慢病毒转染，感染48 h后，观察荧光情况，根据细胞生长情况及时换液、传代及冻存，待用。细胞感染Nrf2增强基因慢病毒或照射UVB后，继续培养24 h进行后续实验，并在非荧光倒置光镜下观察细胞形态、数目及细胞状态。UVB光源距细胞15 cm，照射30 s，总剂量为30 mJ/cm2。对照组、Nrf2组细胞注意避光。

4.CCK8试剂盒检测细胞活力：按试剂盒说明书操作处理上述4组细胞，采用酶标仪于450 nm波长处测定各组细胞的吸光度（A值）。细胞活力=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

5.TNF-α、IL-6、SOD含量的测定：取上述4组细胞，按TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒说明书操作，检测各组细胞培养上清液中TNF-α和IL-6含量。取上述4组细胞，按SOD测定试剂盒说明书操作，测定各组细胞SOD酶活力单位（U/mg）。

6.Western印迹检测Nrf2蛋白水平：取上述4组细胞，冰上裂解后，于4℃下12 000 r/min离心10 min（离心半径7 cm），收集上清液，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，测量各组蛋白浓度。各组蛋白样品经电泳、转膜、封闭后，加入Nrf2一抗（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜或室温孵育1 h，洗膜3次，加入二抗（1∶10 000稀释）室温孵育1 h，弃二抗，洗膜3次，加适量预混ECL发光液显影，置于Chem Scope 6000系列化学发光成像机器，采集图像。分析条带信息，目的基因相对表达值为目的基因条带与β肌动蛋白基因条带灰度值的比值。

7.细胞活性氧（ROS）的检测：取上述4组细胞，加入含5 μmol/L超氧化物阴离子荧光探针（DHE）2 μl，于37℃细胞培养箱内孵育20 min，采用无血清培养基洗涤3次，除未进入细胞的DHE。设置空白对照组。使用流式细胞仪于535 nm激发波长和610 nm发射波长检测细胞荧光强度。相对ROS含量=处理组荧光强度/空白对照组荧光强度×100%。

结 果

一、细胞转染情况

倒置荧光显微镜下，MOI值10、20、50、100组细胞的转染效率约为10%、50%、70%、90%。见图1。

二、UVB照射前后HaCaT细胞的形态学变化

倒置显微镜下，正常的HaCaT细胞为多角形，呈簇集状生长，生长状态良好；照射30 mJ/cm2UVB后继续培养24 h时，HaCaT细胞出现皱缩、变圆，漂浮细胞数增多，贴壁数量明显减少。见图2。

三、感染Nrf2增强基因慢病毒对HaCaT细胞Nrf2蛋白水平的影响

图2 照射中波紫外线对HaCaT细胞形态的影响（×200）2A：正常细胞为多角形，呈簇状生长，生长良好；2B：照射后继续培养24 h，细胞出现皱缩、变圆，漂浮细胞数增多，贴壁数量明显减少

对照组、UVB 组、Nrf2组、Nrf2+UVB组Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.84±0.05、0.63±0.08、2.19±0.17、1.43±0.07，差异有统计学意义（F=64.81，P ＜ 0.05），Nrf2组高于对照组（t=14.82，P ＜0.05），UVB组水平低于对照组（t=12.49，P ＜ 0.05）和Nrf2+UVB组（t=7.47，P＜0.05）。见图3。

四、感染Nrf2增强基因慢病毒及照射UVB对HaCaT细胞活力的影响

对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2+UVB组细胞活力差异有统计学意义（P＜0.05），UVB组低于对照组（t=33.34，P ＜ 0.05）和Nrf2+UVB组（t=10.07，P＜0.05）。见表1。

五、感染Nrf2增强基因慢病毒及照射UVB对HaCaT细胞SOD水平的影响

对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2+UVB组SOD水平差异有统计学意义（P＜0.05），UVB组低于对照组（t=11.25，P ＜0.05）和Nrf2+UVB组（t=17.52，P＜0.05）。见表1。

图3 Western印迹检测感染Nrf2增强基因慢病毒及照射中波紫外线（UVB）对HaCaT细胞内Nrf2蛋白水平的影响 1～4：分别为对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2+UVB组。UVB组Nrf2蛋白相对表达水平低于对照组和Nrf2+UVB组

六、感染Nrf2增强基因慢病毒对UVB照射后HaCaT细胞的炎症因子IL-6、TNF-α的影响

对照组、UVB 组、Nrf2组、Nrf2+UVB组IL-6水平差异有统计学意义（P＜0.05），而TNF-α水平差异无统计学意义（P=0.189）。UVB组IL-6水平高于对照组（t=28.48，P＜0.05）和Nrf2+UVB组（t=27.82，P ＜ 0.05）。见表1。

七、感染Nrf2增强基因慢病毒对UVB诱导的HaCaT细胞相对ROS含量的影响

对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2+UVB组相对ROS含量差异有统计学意义（P＜0.05），UVB组高于对照组（t=33.68，P＜0.05）和Nrf2+UVB组（t=12.47，P ＜ 0.05）。见表1、图4。

讨 论

紫外线可导致皮肤损伤，其中UVB能量最高，直接照射于皮肤表皮角质形成细胞时，可产生过多ROS并引起一系列的氧化应激反应，ROS与体内的生物分子如蛋白质、脂质和核酸相互作用，加速皮肤光老化［6］，最终导致各种皮肤损伤。研究显示，Nrf2及其通路通过介导细胞氧化应激损伤，降低炎症信号传导，增加DNA修复和抗氧化剂反应［7-8］，达到对表皮细胞光保护的作用。本研究也发现，UVB照射可引起HaCaT细胞受损，我们采用UVB照射HaCaT细胞后继续培养24 h，发现贴壁细胞明显减少，细胞出现皱缩、变圆，死亡的细胞增多。我们通过对HaCaT细胞转染慢病毒包装的Nrf2增强基因，发现提高Nrf2表达水平可减轻UVB照射对HaCaT细胞的损伤。

表1 感染Nrf2增强基因慢病毒及照射UVB对HaCaT细胞活力及SOD、IL-6、TNF-α、ROS水平的影响（±s）

表1 感染Nrf2增强基因慢病毒及照射UVB对HaCaT细胞活力及SOD、IL-6、TNF-α、ROS水平的影响（±s）

注：n=3。UVB：中波紫外线；SOD：超氧化物歧化酶；IL-6：白细胞介素6；TNF-α：肿瘤坏死因子α；ROS：相对活性氧

组别对照组UVB组Nrf2组Nrf2+UVB组F值P值细胞活力（%）98.00±2.39 24.40±2.98 71.63±3.39 43.38±3.39 64.81＜0.05 SOD水平（U/mg）228.02±15.68 114.04±7.85 321.29±13.96 150.84±9.42 170.76＜0.001 IL-6水平（ng/L）758.32±223.30 6 510.12±269.25 1 540.04±90.73 5 592.95±235.47 532.34＜0.001 TNF-α水平（ng/L）215.85±31.10 243.73±48.53 178.09±38.70 183.13±27.28 2.02 0.189相对ROS含量（%）1.27±0.10 5.65±0.19 2.10±0.73 3.67±0.19 481.39＜0.001

图4 流式细胞仪检测感染Nrf2增强基因慢病毒对中波紫外线诱导的HaCaT细胞活性氧（ROS）水平的影响 UVB组ROS相对水平高于对照组和Nrf2+UVB组

HaCaT细胞在感染Nrf2增强基因慢病毒后，Western印迹显示，细胞内Nrf2水平显著升高，说明Nrf2增强基因的转染成功，UVB组Nrf2水平低于对照组，提示感染Nrf2增强基因慢病毒可缓解UVB照射对降低HaCaT细胞Nrf2水平的影响。Nrf2作为抗氧化反应的主要调节因子，在氧化应激状态下与ARE结合成为Nrf2/ARE通路，两者同时对机体细胞内的氧化应激状态进行调节，可以进行炎症信号传导，DNA修复和抗氧化剂反应。本研究通过CCK8法测得各组细胞生存率显示，UVB照射后细胞生存率低于对照组，但感染Nrf2增强基因慢病毒后，Nrf2+UVB组细胞存活率较UVB组升高，表明感染Nrf2增强基因慢病毒能够提高UVB诱导的HaCaT的生存率。我们还通过检测HaCaT细胞的ROS荧光强度发现，UVB组细胞产生ROS增多，而与UVB组相比，Nrf2+UVB组ROS产生量减少。这些结果提示，转染Nrf2基因通过抑制细胞内ROS的产生，提高UVB照射后HaCaT细胞的存活率。在正常情况下，人体内有诸多受Nrf2/ARE通路调控抗氧化的酶，如SOD、谷胱甘肽硫转移酶、血红素氧合酶1等，可有效地对抗机体内的氧化应激损伤。SOD有特定生物催化功能，可清除自由基及炎症因子，对细胞的光损伤有一定的保护作用。本研究发现，UVB照射可使细胞内SOD活力显著降低，表明UVB照射加快HaCaT细胞的氧化损伤，而转染Nrf2过表达基因后SOD活力上升，提示Nrf2可提高细胞内抗氧化酶水平，增加抗氧化应激能力。

作为重要的免疫器官，皮肤在受外界刺激（如紫外线照射）后会激活一系列氧化应激通路，产生多种炎症因子。紫外线诱发的皮肤炎症过程中主要产生IL-6、IL-8及TNF-α，IL-6可加速基质金属蛋白酶1的分泌，刺激表皮增生，与多种皮肤炎症相关，如特应性皮炎、银屑病和光老化等疾病。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生，且能进一步诱导表皮细胞产生 IL-2、IL-6，加重炎症反应［9］。Saw等［10］对Nrf2基因敲除小鼠和Nrf2基因野生型小鼠使用Nrf2活化剂后照射UVB，发现野生型小鼠比Nrf2基因敲除小鼠更容易将晒伤细胞的数量、炎症因子恢复到它们的基础水平。本研究显示，经UVB照射后，HaCaT细胞培养上清液中的IL-6含量高于对照组，而Nrf2+UVB组的IL-6生成量少于UVB组，提示Nrf2可抑制IL-6的分泌，减轻UVB照射引起的炎症反应及细胞损伤。本研究也检测了另外一种常见的炎症因子TNF-α，发现照射UVB与感染Nrf2增强基因慢病毒对HaCaT细胞TNF-α的分泌无明显影响，其原因仍有待研究。

本实验证实，UVB照射能造成体外培养的HaCaT细胞损伤，而Nrf2在细胞的光损伤中具有保护作用，这种保护作用可能与其抗氧化应激通路密切相关。本实验为Nrf2基因激动剂及激活Nrf2通路对抑制紫外线造成的光损伤的保护作用提供了一定的理论依据，有望用于临床。但本实验结果仅是在细胞及分子水平的体外研究，且部分抗氧化及体内保护机制尚未完全清楚，有待深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突