成纤维细胞生长因子受体FGFR1 真核表达质粒的构建及其在HEK293T 细胞的表达

金锦花，李科岩，张 玲，王玉慧，邓晓明

（中国医学科学院，北京协和医学院整形外科医院麻醉科，北京 100144）

酪氨酸激酶受体由20 个家族，近60 种膜蛋白组成。人类成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）是酪氨酸激酶受体家族中的一员，由四个高度保守的跨膜受体（FGFR1-4）和一个无细胞内结构域（FGFR5）受体组成，主要集中在细胞表面[1-3]。

FGFR1 在幼年期或伤口愈合期扩张皮肤中的成纤维细胞和角质细胞中表达[4-5]，FGFR1 的不适当表达、点突变、错误的选择性剪切以及基因组改变都可导致FGF/FGFR1 信号传导的调控紊乱[6-8]。为深入研究FGFR1 在皮肤创伤修复发生过程中的作用机制，笔者构建了FGFR1 真核表达载体pcDNA3.1-FGFR1，为后继研究FGFR1 的医学应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂真核表达载体p-CDNA3.1（-），E Coli.DH5a 菌株，HEK293T 细胞为本实验室保存。LipofectamineTM 3000 购于美国Invotrigen 公司。逆转录酶，Pyrobest 高保真DNA 聚合酶，限制性核酸内切酶BamH I and Hind III，T4 连接酶均购于日本Takara 公司。鼠抗人HA 单克隆抗体，HRP-山羊抗鼠二抗购自Cell Signaling Technology 公司。Goat anti-mouse Cy3 二抗购自Thermo 公司。其他化学试剂为国产分析纯。

1.1.2 引物设计及合成参照GenBank 的FGFR1基因序列（NM_023110.2），采用Primer 5.0 软件设计引物:（1）克隆FGFR1 基因的引物：上游引物序列为5'-ATATGGATCCGCCGCCACCATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列为5'-AAGCTTTCACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGCGGCGTTTGAGTCCGCCA-3'，为了便于和载体pCDNA3.1 连接，在此对引物的两端分别加入了BamH I and Hind III 酶切位点。为了便于后续对表达蛋白的检测，在下游引物中加入了HA 标签的序列；（2）pcDNA3.1-FGFR1 质粒的鉴定引物：上游引物序列为5'-ATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列为5'-TCAGCGGCGTTTGAGTCCGC-3'，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 FGFR1 基因的克隆采用RNA 抽提试剂盒（Qiagen 公司）提取人胎盘组织中的总RNA，并以总RNA 为模板，用Takara 公司的逆转录酶进行逆转录，获得cDNA。PCR 扩增FGFR1 基因，扩增片段长度为2 469 bp。

1.2.2 pcDNA3.1-FGFR1 表达载体的构建及载体鉴定限制性核酸内切酶BamH I and Hind III 对PCR 产物及质粒pcDNA3.1 进行双酶切后，在T4 DNA 连接酶作用下16 ℃连接过夜。氯化钙转化后，将转化的菌液涂布于含氨苄青霉素（Amp）的平板上，37 ℃培养12～16 h，挑取阳性克隆，进行BamH I 和Hind III 双酶切鉴定和PCR 鉴定，阳性质粒的菌液送北京擎科生物技术有限公司测序。

1.2.3 细胞培养及细胞基因转染转染前1 d 将HEK293T 细胞按3×105/mL 分别接种于6 孔板内。待细胞贴壁后将2.5 μg质粒 DNA，5 μL lipofectamineTM3000，用500 μL opti-MEM 培养基稀释并混匀，室温静置15 min；将DNA／lipofectamine 3000 混合物加入6 孔板，培养箱中孵育5 h 后换液。

1.2.4 免疫印迹检测FGFR1 基因在HEK293T 细胞中的表达pcDNA3.1-FGFR1 质粒转染293T 细胞48 h，裂解细胞，12%的SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳结束后用湿转移法，电转印到0.22 μm 孔径的PVDF 膜上，在5%BSA 室温封闭2 h。加入鼠抗人HA 一抗（1:3 000），兔抗人β-actin 一抗（1:3 000），4℃孵育过夜。一抗充分漂洗后，二抗室温孵育1 h，加入HRP 显色底物，X 光片曝光显影。

1.2.5 免疫荧光检测FGFR1 基因在HEK293T 细胞中的表达细胞接种在盖玻片上培养，待细胞达到70%汇合度时，pcDNA3.1-FGFR1 质粒转染细胞48 h，4%多聚甲醛室温固定15 min，滴加鼠抗人HA 抗体液，4℃孵育过夜。一抗漂洗后再分别用CY3 一抗鼠IgG 孵育45 min，PBS 洗后，DAPI 复染核，抗淬灭封片剂封片。

2 结果

2.1 提取完整的人胎盘组织总RNA

从图1 中可以清晰地看到28 S，18 SrRNA 两条主带清晰，表明所提的总RNA 完整性较好，无明显降解，可用于后续RT-PCR 反应。

图1 人胎盘组织总RNA 电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from human placenta tissue

2.2 克隆FGFR1 基因

PCR 产物的电泳结果显示，得到了一条特异性条带（图2），与预期扩增的片段大小（2 469 bp）一致，而且无非特异性条带的干扰，扩增的特异性较强。

图2 FGFR1 基因的克隆Fig.2 Cloning of FGFR1 gene

2.3 正确构建pcDNA3.1-FGFR1 真核表达质粒

电泳结果（图3）显示，两条片段大小分别为5.5 Kbp 和2 469 bp，表明目的片段已成功的克隆在pcDNA3.1 载体上。将阳性重组质粒进行测序，结果证明本文扩增的FGFR1 cDNA 序列与基因库的序列完全一致。

图3 双酶切法鉴定pcDNA3.1-FGFR1 质粒Fig.3 Identification of the pcDNA3.1-FGFR1 by restrictive enzyme digestion assay with BamH I and HindIII

2.4 免疫印迹分析FGFR1 基因在HEK293T 细胞中的高效表达

结果见图4，转染pcDNA3.1-FGFR1 的HEK 293T 细胞裂解产物有一条明显的特异性条带，大小约130 KD，而对照组（转染pCDNA3.1 载体的HEK293T 细胞）结果为阴性。表明转染pCDNA3.1载体的HEK293T 细胞中高水平地表达了外源性的FGFR1 因子。实验重复3 次以上，结果均一致。

图4 免疫印迹分析FGFR1 在HEK293T 细胞的表达Fig.4 Immunoblot analysis of FGFR1expression in HEK293T cells

2.5 免疫荧光分析FGFR1 基因在HEK293T 细胞中的高效表达

免疫荧光染色分析（图5）表明，在对照组细胞（转染pCDNA3.1 载体的HEK293T 细胞）的细胞膜中没有FGFR1 的表达（图5A）。而在细胞膜中有较强的红色荧光信号（图5B）

3 讨论

成纤维细胞生长因子（FGFs）是一组同源的肝素结合多肽，其家族包含23 个成员[9]，它们具有很高的序列同源性及类似的生物学功能[10]。FGFs具有广泛的生物学功能，可以调控胚胎发育中细胞的增殖、迁移、分化；参与机体内血管生成、组织修复；维护正常机体组织内的结构和功能。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptors，FGFR）是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体，其家族成员都是酪氨酸激酶受体[11]，FGFR 失调与多种癌症有关，如尿路上皮癌、肝细胞癌、卵巢癌和肺腺癌[12-15]，由于其重要的功能，FGFR 被认为是治疗各种癌症的药物靶标[16-17]。在多种成纤维细胞生长因子受体中，FGFR1 在伤口愈合、生长发育、骨骼形成、细胞的增殖、分化、血管生成等进程中起着十分重要的作用[18-22]，以FGFR1 为研究方向的皮肤创伤愈合治疗，展现了可期的应用前景[23]，如果笔者能够获得FGFR1真核表达载体，就有可能将其应用于后续皮肤创伤的治疗研究。

图5 免疫荧光分析FGFR1 在293T 细胞的表达Fig.5 Immunofluorescence analysis of FGFR1 expression in 293T cells

本实验成功构建了小鼠FGFR1 重组真核表达质粒pcDNA3.1-FGFR1，并通过脂质体转染技术让其在HEK293T 细胞表达，为进一步研究FGFR1在胚胎发育期及创伤修复过程中的皮肤修复奠定实验基础。本研究的创新点在于通过免疫荧光手段分析FGFR1 在293T 细胞表达以后在细胞的定位情况，通过基因工程手段给FGFR1 加上HA 标签，方便后期的western blot 检测和免疫荧光检测，以及将来研究免疫共沉淀技术检测FGFR1 和其他分子的相互作用。