钙离子对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

田红彪，王玉霄，王燕，郑晓拓，张瑞红，孙丽静

（保定市第四中心医院检验科，河北 保定 072350）

铜绿假单胞菌作为医院主要的条件致病菌之一，由于抗菌药物尤其是广谱抗生素的不合理使用，导致多重耐药菌株的产生，使得临床常用的抗菌药物治疗无效。铜绿假单胞菌的耐药机制有多方面，生物膜的形成是其重要的耐药机制之一，因为生物膜的存在，铜绿假单胞菌逃避了免疫监视，使细菌避免暴露在抗菌药物之下，原本敏感的抗菌药物在临床上治疗效果差或无效。清除细菌生物膜，让细菌重新暴露在敏感的抗菌药物环境之下，抗菌药物发挥应有的杀菌作用，是我们应该研究的一个方向。

1 材料与方法

1.1 材料 胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供），平板计数培养基（杭州百思生物技术有限公司提供）。

1.2 收集临床分离的10株铜绿假单胞菌菌株，分别制备成菌悬液约0.5麦氏单位。

1.3 制备胰蛋白大豆肉汤培养基，9 mL/支分装，高压灭菌备用。

1.4 制备平板计数培养基。

1.5 配制不同浓度的CaCl2溶液，浓度分别为5、15、45 mmol/mL。

1.2 方法

1.2.1 每个菌株取4支试管，分别编号0、1、2、3。

1.2.2 在0-4号试管中依次加入1 mL蒸馏水0、5、15、45 mmol/mL的CaCl2溶液。

1.2.3 吸取菌悬液10 μL分别接种于到上述试管中，放置摇床37 ℃培养。

1.2.4 分别在6、12和24 h经超声波振荡，用PBS连续10倍稀释接种于平板计数培养基35 ℃ 48 h培养，进行菌落计数，计算平均值（表1）。

1.2.5 接种铜绿假单胞菌的胰蛋白大豆肉汤培养基继续培养至72 h，观察生物膜的絮状物颗粒形成情况。

1.2.6 生物膜形成后滴加冰乙酸直至pH接近3.5，观察生物膜的变化（图1）。

2 结果

2.1 从表1中可以看出随着钙离子浓度的升高铜绿假单胞菌菌落数也随之增加。

2.2 从图1中可看到铜绿假单胞菌生物膜絮状物颗粒随钙离子浓度的升高而增大。

2.3 加入EDTA的液体培养基铜绿假单胞菌菌落数和生物膜絮状物颗粒减少。

2.4 加入冰乙酸后铜绿假单胞菌生物膜絮状物颗粒并没有立即完全消失。

3 讨论

细菌生物膜是指正常细菌与细胞表面受体结合而黏附，并分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等胞外多糖聚合物，是细菌以非常精细的方式相互黏连所形成的膜样结构[1]。生物膜的形成是一个动态过程，包括细菌起始黏附、生物膜发展、生物膜扩散和裂解等阶段。在细菌黏附阶段由于缺乏生物膜的保护，抗菌药物易于发挥作用，几乎所有的铜绿假单胞菌都可以形成生物膜，王忠等[2]的研究发现经过72 h左右后铜绿假单胞菌能够形成稳定的生物膜。临床治疗铜绿假单胞菌引起的感染应当在72 h内采用有效的抗感染治疗。细菌生物膜造成的慢性感染给临床治疗带来了非常棘手的难题。

任何细菌均可形成生物膜，这是细菌的一种本能。具体某一种细菌能否形成生物膜，取决于生存环境，包括营养成分、温度、渗透压、pH、阴阳离子浓度等。密度感应系统作为一种信息交流调控机制，在细菌生物膜的形成和成熟中起着重要的作用。生物膜一旦形成，菌体之间彼此聚集促使微菌落形成，这便是菌体逃避机体免疫监视及免被抗生素清除的主要原因[3]。目前认为，高浓度的钙离子可以稳定和促进细胞外多糖的释放，增加生物膜结构的聚集性和抑制生物膜的分解的功能[4]。在富含钙离子培养基中的铜绿假单胞菌生物膜厚度是不含钙离子培养基的10倍[5]，可见钙离子是促进生物膜的形成重要因子之一。Banin等[6]发现往培养基中加入EDTA，已形成的铜绿假单胞菌BF会发生降解破裂，促使铜绿假单胞菌从被膜中游离出来，并且EDTA对游离出被膜的细菌有杀灭作用。同时考察加入饱和量的Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+四种离子对EDTA对被膜中的菌的游离效应的阻断作用，发现只有加入Fe2+后能完全阻断EDTA的效应，Mg2+、Ca2+只能部分阻断。目前生物膜常用的物理清除方法主要有机械清除、超声波、化学清除剂作用机理各不相同，主要包括天然产物、金属离子如铜离子、表面活性剂和酶等。乙酸等弱有机酸及抗细菌生物膜能力的主要机制在于未解离状态的算可以自由扩散通过膜的疏水层，破坏膜内微环境的阳离子及阴离子平衡，导致进入细胞内的乙酸开始解离、游离的氢离子逐渐积累，细胞内蛋白降解、膜性结构及DNA结构损坏[7]，研究显示乙酸确实有清除生物膜的作用。而生物清除主要是通过噬菌体杀死细菌细胞来瓦解生物膜的结构，达到裂解和分散生物膜的目的。临床治疗有细菌生物膜引起的慢性感染，药敏试验报告敏感的抗菌药物往往治疗效果差或无效，与铜绿假单胞菌生物膜有关，通过控制细菌生存的微环境，不能形成生物膜，使细菌处在浮游菌状态，充分暴露在抗菌药物环境下，避免发生免疫逃逸，才能使敏感的抗菌药物发挥应有的作用，感染病灶才可彻底治愈。

表1 不同浓度CaCl2和EDTA的TSB菌落计数平均值