酸水解—乙醇沉淀法中pH调节对柚皮果胶品质的影响

庄远红，曾 培

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000)

果胶是以D-吡喃半乳糖醛酸为基本单位的多糖高分子亲水性胶状化合物，是植物细胞壁的组成成分之一[1]，具有良好的乳化、增稠、胶凝和稳定作用，被广泛用于食品工业中，也是医药和化妆品工业不可缺少的辅料[2-3].柚皮是柚子加工的副产物，占整个柚子的40%，含有丰富的膳食纤维和果胶等非营养性生理活性物质[4]，可以作为提取果胶的原料.陈艳红等[5]、沈锐等[6]采用酸水解—乙醇沉淀法从柚皮中提取果胶，并通过果胶提取率对提取工艺进行了优化，但目前很少有深入探讨各提取因素对柚皮果胶品质的影响，特别是提取过程中pH的影响的报道.因此，本试验拟通过酸水解—乙醇沉淀法从柚子白皮中提取果胶，研究提取过程中pH，即酸解液pH和醇沉液pH对果胶提取率、色泽、粘度、半乳糖醛酸含量和酯化度的影响，旨在为获得高品质果胶提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

供试琯溪蜜柚由福建省漳州市平和县蜜柚种植基地提供.

主要仪器与设备有JHBE-50A闪式提取器(北京金鼎科技发展有限公司)、EL-20实验室pH计(梅特勒—托利多上海有限公司)、RE52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、LG-0.2型真空冷冻干燥机(沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司)、UV-200紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、LVDV-Ⅱ+PRO旋转粘度计(美国Brookfield公司)、ColorFlexTM色差仪(美国HunterLab公司)、JSM-6010LA扫描电子显微镜(日本电子株式会社).

1.2 样品制备

参照文献[7-9]的方法制备.将新鲜柚子白皮剪成0.5 cm×0.5 cm的粒状，按15∶1(mL∶g)的液料比加入蒸馏水，闪式破碎60 s(电压100 V)，用6 mol·L-1HCl调节酸解液至一定的pH，微波煮至微沸后，于85 ℃水浴回流30 min，趁热用300目滤布抽滤，滤液于75 ℃下，以70 r·min-1旋转蒸发浓缩至可溶性固形物含量为8%，冷却，用2%稀氨水调节浓缩液至一定的pH，在不断搅拌下加入2倍体积的95%乙醇，醇沉12 h，用300目滤布双层抽滤除去乙醇后，再用乙醇洗涤2次，抽滤，沉淀物加入2倍体积的水加热溶解，于75 ℃下，以70 r·min-1旋转蒸发浓缩至可溶性固形物含量为5%，真空冷冻干燥即得果胶，粉碎后备用.

1.3 试验设计

1.3.1 酸解液pH对柚皮果胶品质的影响 液料比为15∶1(mL∶g)，闪式破碎60 s，酸解液pH分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，水浴回流30 min，水解温度85 ℃，醇沉液pH为4.5.

1.3.2 醇沉液pH对柚皮果胶品质的影响 液料比为15∶1(mL∶g)，闪式破碎60 s，水浴回流30 min，水解温度85 ℃，酸解液pH为1.5，醇沉液pH分别设置为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0.

1.4 果胶指标测定及表观形貌的检测

1.4.1 果胶提取率 果胶提取率/%=冻干后果胶质量/新鲜柚子白皮冻干质量×100.

1.4.2 色差 参考彭凯等[10]的方法测定并稍作修改.将果胶粉均匀地平铺在比色杯中，以白板为标样，采用 Hunter Lab表色系统，用ColorFlexTM色差仪快速检测果胶的色差值ΔE.ΔE越小表示样品颜色越接近白板，越大表示样品与白板的差异越大.

1.4.3 粘度 参考高建华等[11]的方法测定并稍作修改.配制质量浓度为15 g·L-1的果胶溶液，充分搅拌均匀，用LVDV-Ⅱ+PRO旋转粘度计(转子：S62，转速6.0 r·min-1)于室温下测定粘度值.

1.4.4 半乳糖醛酸含量 利用半乳糖醛酸含量衡量果胶含量，采用咔唑比色法，参照耿敬章等[12]的方法并略加修改.吸取1 mL 40 μg·mL-1果胶稀释液，于冰浴下加入6 mL浓硫酸，混匀后，在沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，再加入0.2 mL 1.5 mg·mL-1咔唑，摇匀，在暗处放置2 h后于530 nm波长处测定光密度，根据标准曲线计算半乳糖醛酸含量.

1.4.5 酯化度 参照Schmidt et al[13]的方法测定.取0.2 g果胶用2 mL乙醇湿润，加入20 mL不含CO2的蒸馏水(40 ℃)，塞紧瓶塞并振摇，使果胶全部溶解，加入3滴酚酞，用0.1 mol·L-1NaOH滴定至变红，记录消耗的NaOH体积(V1，为初始滴定度)；加入10 mL 0.1 mol·L-1NaOH，剧烈振荡2 h，静置15 min，加入10 mL 0.1 mol·L-1HCl，振荡，直到粉红色消失；加入3滴酚酞，再用0.1 mol·L-1NaOH滴定至浅红色，记录消耗的NaOH体积(V2，为皂化滴定度).果胶酯化度/%=V2/(V1+V2)×100.

1.4.6 果胶表观形貌的检测 采用扫描电子显微镜在10 kV的加速电压下观察果胶粉末的表观形貌.

1.5 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据处理，应用SPSS 23软件进行显著性分析.

2 结果与分析

2.1 pH对柚皮果胶提取率的影响

酸解液pH和醇沉液pH的变化对柚皮果胶提取率的影响如图1所示.从图1A可知，柚皮果胶的提取率随着酸解液pH的升高极显著降低(P<0.01).pH为0.5时，提取率最高，这可能是高酸性环境有助于非水溶性原果胶转化为水溶性果胶，提取率较高；但酸度也不可过高，否则果胶容易炭化变黑影响品质.酸度降低时原果胶不能完全水解使提取率偏低[9].由图1B可知，随着醇沉液pH的升高(3.04.5时，提取率降低.果胶醇沉是通过降低水溶液的介电常数使果胶脱水沉淀从而分离果胶，因此，醇沉液pH会影响果胶沉淀的效果.果胶作为一种酸性多糖，在水中会离解出氢离子，果胶的酸解离常数通常为3.5～4.5，当pH=pKa时，果胶电离平衡，此时果胶溶解度最低，沉淀效果最好[14].

图中附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05).图1 pH对柚皮果胶提取率的影响Fig.1 Effect of pH on the yield of pomelo peel pectin

2.2 pH对柚皮果胶色泽的影响

酸解液pH和醇沉液pH的变化对柚皮果胶色泽的影响如图2所示.根据GB 25533—2010[15]对果胶色泽的规定，应为白色、淡黄色、浅灰色或浅棕色.以白板为标样，ΔE越小说明果胶色泽越白，商品价值越高.从图2A可知，随着酸解液pH的增大，柚皮果胶的ΔE变小，当0.50.05)，但酸解液pH为1.5时提取的果胶ΔE比pH为1时小，色泽更白.

图中附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05).图2 pH对柚皮果胶色差的影响Fig.2 Effect of pH on the color value of pomelo peel pectin

从图2B可知，柚皮果胶的ΔE随着醇沉液pH的增大由17.12增加到18.42，但各处理的ΔE差异不大.有研究认为：ΔE为0～1，肉眼分辨不出色差；ΔE为1～2，肉眼可以轻微察觉到[17].从图2B可以看出，肉眼无法分辨各处理果胶之间的色差，可以认为醇沉液pH对柚皮果胶色泽的影响不大，均为淡黄色.

2.3 pH对柚皮果胶液粘度的影响

酸解液pH和醇沉液pH的变化对柚皮果胶液粘度的影响如图3所示.从图3A可知，酸解液pH对果胶液粘度的影响达到极显著水平(P<0.01)，果胶液粘度随着酸解液pH的升高而增大，这可能是酸性环境使果胶分子中性糖侧链水解，果胶结构被破坏[8]，粘度随着酸度的升高而降低.由图3B可知，随着醇沉液pH的升高，果胶液粘度呈先增大后减小的趋势，差异极显著(P<0.01).醇沉液pH为3.5时的粘度最高，pH>3.5时粘度开始下降，原因是pH改变了果胶酸的电离度，果胶液中加入氨水，果胶酸电离度增大，库伦斥力使链得以伸展，粘度增大，但氨水加入过多时果胶发生解聚和脱酯反应，粘度下降[18].因此，氨水添加量不可过多，氨水调节醇沉液pH时应剧烈搅动，以免局部碱性过高而发生脱酯和解聚反应.

图中附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05).图3 pH对柚皮果胶液粘度的影响Fig.3 Effect of pH on the dynamic viscosity of pomelo peel pectin liquid

2.4 pH对柚皮果胶半乳糖醛酸含量的影响

酸解液pH和醇沉液pH的变化对柚皮果胶半乳糖醛酸含量的影响如图4所示.半乳糖醛酸含量可以衡量果胶的纯度.从图4A可知，酸解液pH对半乳糖醛酸含量的影响显著(P<0.05)，随着酸解液pH的升高，果胶的半乳糖醛酸含量由59.6%显著降低到38.8%，表明果胶纯度随着酸解液pH的升高而降低.这是因为低pH下柚皮中的纤维素和淀粉等水解为不能被乙醇沉淀的小分子多糖，进而提高了沉淀下来的果胶的纯度，而随着pH逐渐增大，酸水解性能减弱，淀粉等被乙醇沉淀，导致果胶纯度降低[19].

图中附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05).图4 pH对柚皮果胶半乳糖醛酸含量的影响Fig.4 Effect of pH on the galacturonic acid content of pomelo peel pectin

从图4B可以看出，随着醇沉液pH的升高，提取的果胶半乳糖醛酸含量呈先增加后减少的趋势，各处理之间的差异达到显著水平(P<0.05).醇沉液pH为4.5时的半乳糖醛酸含量最高，为51.2%；当醇沉液pH<4.5时，半乳糖醛酸含量随着pH的升高而逐渐增加；当 pH>4.5时，半乳糖醛酸含量迅速下降.可能是因为pH增大，发生β-切断反应，产生双键并导致链的断裂[20]，一定程度上破坏了果胶的分子结构，半乳糖醛酸含量降低，这与邹荣[21]的研究结果一致.

2.5 pH对柚皮果胶酯化度的影响

酯化度指果胶分子中半乳糖醛酸上的羧基甲酯化的程度.从图5A可知：随着酸解液pH的升高(0.52.0后酯化度增加不明显(P>0.05).因为低pH下果胶半乳糖醛酸链上的酯化键易发生酸水解[8]，从而降低酯化度.一般情况下，酯化度大于50%的果胶为高酯化度果胶[22].可见，酸解液pH为0.5～2.5时，提取的果胶均为高酯果胶.

图中附不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，附不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05).图5 pH对柚皮果胶酯化度的影响Fig.5 Effect of pH on the esterification degree of pomelo peel pectin

从图5B可知，柚皮果胶酯化度随着醇沉液pH的增大呈先增加后减少的趋势.当醇沉液pH<4.0时，酯化度增加缓慢，变化趋势不明显，可以认为醇沉液pH为3.0～4.0时对酯化度影响不大；但pH>4.0时，酯化度极显著下降(P<0.01)，可能是因为碱性过强导致果胶发生脱酯反应.醇沉液pH为3.0～5.0时，提取的果胶酯化度均大于50%，均为高酯化度果胶.

2.6 提取率与理化特性的相关性

由表1可知，柚皮果胶的提取率与色差、粘度、酯化度、半乳糖醛酸含量均无相关性(P>0.05)，而与酸解液pH呈极显著负相关(r=-0.981，P<0.01)，与醇沉液pH呈极显著正相关(r=0.969，P<0.01).因此，柚皮果胶的提取率主要受提取过程中pH的影响，可以通过适当降低酸解液pH和提高醇沉液pH来提高果胶的提取率.柚皮果胶的色差、粘度、酯化度、半乳糖醛酸含量与酸解液pH之间呈极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)相关性，而与醇沉液pH无显著相关性(P>0.05).因为过低的酸解液pH使纤维素等水解，果胶中性链断裂水解，结构被破坏，造成果胶颜色较深，粘度和酯化度变小，但半乳糖醛酸含量增高.

表1 柚皮果胶提取率与理化特性的相关系数1)Table 1 Correlation between extraction rate and physicochemical properties of pomelo pectin

1)*表示在0.05水平(单侧)上显著相关，**表示在0.01水平(单侧)上显著相关.

2.7 柚皮果胶的表观形貌

在酸解液pH为1.5，醇沉液pH为4.5的条件下制备的果胶在扫描电子显微镜(放大300倍)下的表观形貌如图6所示.从图6可以看出，柚皮果胶呈现比较完整的不规则片状结构，薄度较均一，表面裂纹少[23].因为本产品果胶是通过真空冷冻干燥后粉碎获得的，真空冷冻干燥能保持产品的完整性，粉碎后片状结构保持较好.

3 结论

图6 柚皮果胶的表观形貌Fig.6 Morphology of pomelo peel pectin under scanning electron microscope

在酸水解—乙醇沉淀法中，酸解液pH和醇沉液pH对柚皮果胶的提取率和品质有较大影响.酸解液pH与柚皮果胶的粘度、酯化度之间呈极显著正相关(P<0.01)，与色差、提取率呈极显著负相关(P<0.01),与半乳糖醛酸含量呈显著负相关(P<0.05)；醇沉液pH与柚皮果胶的品质特性无显著相关性，但与提取率呈极显著正相关(P<0.01).低酸解液pH和高醇沉液pH有利于提高提取率.酸解液pH为1.5，醇沉液pH为4.5时，果胶提取率最高，为14.87%，半乳糖醛酸含量也相对较高，果胶呈淡黄色，为高酯果胶，但色泽、粘度和酯化度不如醇沉液pH为4.0的好.扫描电子显微镜下观察显示，真空冷冻干燥能保持果胶结构的完整性，果胶表观形貌呈比较完整的不规则片状结构，薄度均一，表面裂纹少.