高效液相色谱法测定蔬菜中硝基苯

(1.榆林职业技术学院 化学工程系， 榆林 719000；2.榆林学院 信息工程学院，榆林 719000)

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪：由RO230溶剂管理器、DAD230+二极管阵列检测器、ZW230II色谱柱温箱、P230高压恒流泵组成(大连依利特仪器有限责任公司生产)；高速组织捣碎机(德国IKA公司)；H1750台式高速离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试剂

硝基苯母液：浓度1000mg/L，购自国家标准物质中心。

硝基苯标准使用液：取硝基苯母液若干稀释配制，浓度分别为0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L。

甲醇： HPLC Grade，Honeywell Burdick&Jackson公司生产；乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；四氢呋喃;色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；正己烷：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；无水硫酸钠 ： 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；丙酮：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；硫酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；高纯水(自制，二次蒸馏水经0.25um水相滤膜过滤后使用)。

1.3 样品前处理

把蔬菜(以茼蒿、莴苣、胡萝卜为样品)切成 1～ 2cm的段状，准确称取约200g样品，加入100mL 10%硫酸溶液(密度1.07g/mL)，样品加硫酸溶液总重307克，用组织捣碎机捣碎至匀浆，制备成均匀样品，称取上述匀浆样品15.35克(相当于10.0 g样品的量)，置于100 mL塑料离心管中，加入40 mL丙酮-正己烷(1:9，v/v)，于均质机上高速均质3 min，3800 r/min离心5 min，提取液移入250 ml分液漏斗中，加入100 mL20 g/L硫酸钠水溶液，于分液漏斗振荡器上160 rpm/min振荡2 min，静置分层，将下层溶液转移到另一250 mL分液漏斗中，用20 mL正己烷萃取，合并两次正己烷萃取液，用无水硫酸钠脱水(或转入K-D浓缩器中浓缩并定容)备色谱分析用。

2 实验条件优化

2.1 色谱柱的选择

比较了5种不同型号的反相色谱柱对硝基苯的分离效果：

Diamonsil C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)；Asahipak色谱柱(5μm，4.0mm×250mm)；nucleodurC18ec色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)；Waters biosuite色谱柱(5μm，4．6mm×35mm)；

SinochromODS-BP色谱柱(5μm，4.6mm×200mm)。

结果表明，硝基苯通过SinochromODS-BP色谱柱(5 μm，4.6mm×200 mm) 色谱柱峰形最好，与其他可能的干扰物质分离效果最好，可以充分满足测定要求。因此，选择SinochromODS-BP色谱柱作为分析柱。

2.2 流动相选择

通过比较四氢呋喃-水、乙腈-水，甲醇-水这3种混合流动相体系，发现甲醇-水混合流动相体系能够很好的分离硝基苯，峰形良好，不会出现峰拖尾，鬼峰，平头峰，以及其他不完全出峰的情况，出峰结果见图1、图2、图3。

图1 0.5mg/L 硝基苯标准溶液色谱图四氢呋喃-水体系 v/v=10∶90，流速1mL/min-1

图2 0.5mg/L 硝基苯标准溶液色谱图乙腈-水体系 v/v=60∶40，流速1mL/min-1

图3 0.5mg/L硝基苯标准溶液色谱图甲醇-水体系 V/V=85∶15，流速1mL/min-1

甲醇和水的比例不同，可以导致出峰时间不同，峰形不同，以及分离度的差异，经过不同的体积比选择，本方法选择甲醇∶水v/v=85∶15，硝基苯出峰时间为3.516min。

2.3 检测波长的选择

对硝基苯标准溶液进行紫外-可见光全波长扫描分析，在264 nm 波长附近有最大吸收，过低的吸收波长基线噪音大，容易造成干扰，过高的吸收波长例如350 nm 波长之后基本上无吸收，综合考虑硝基苯的紫外光谱特性，最后选择264 nm 作为定值波长;，并利用硝基苯的保留时间和紫外光谱特性进行定性分析。

2.4 方法的精密度、线性关系和检出限

分别取硝基苯标准储备液若干体积稀释到 0.25、0.5、0.75 、1.0、2.0mg/L作为硝基苯的测定使用液，然后每一个浓度测定6次，实验结果见表1、表2。

表1 0.75mg/L 硝基苯溶液保留时间测定数据 min

表2 不同浓度硝基苯溶液峰面积测定及回收率实验 mg/L

根据不同浓度硝基苯对应的峰面积值，可以求得线性回归方程为A=81.115C-0.1193，线性相关系数值为0.9998，以3倍信噪比(S/N)计算硝基苯的检出限为0.1mg/kg

由实验数据可以得到峰面积测定RSD在1.06%～4.97%之间，加标回收率在99.5%～101.9%之间，0.75 mg/L硝基苯使用液保留时间数据RSD等于0.93%，以3倍信噪比(S/N)计算硝基苯的检出限为0.1mg/kg由此可见方法的精密度和准确度良好，灵敏度高。

2.5 实际样品测定

对随机购自农贸市场的茼蒿、莴苣和胡萝卜共 10 份样品，进行前处理及测定，样品未检出含有硝基苯。检测结果表明，市售芦笋、莴苣和胡萝卜没有受硝基苯的污染。

3 结论

本实验选用反相高效液相色谱分析蔬菜中硝基苯，在采用均质、高速离心提取、萃取前处理后，甲醇/水作为混合流动相的条件下，可以得到良好的分离效果。该方法精密度好，准确度高，检出限低，线性关系良好，具备良好的应用前景。