基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨白藜芦醇改善大鼠化疗性卵巢损伤的机制

朱小丹 董若曦 陈 燕 姚馨怡 许文娟 樊伯珍 夏 红

卵巢储备减退(diminished ovarian reserve, DOR)指女性卵母细胞的数量减少和(或)质量下降，伴抗苗勒管激素水平降低，窦卵泡数减少，FSH升高，表现为生育能力下降[1]。近年来，随着肿瘤癌症发病年轻化，化疗药物使用所导致的卵巢储备低下引起了临床的关注。对于化疗性卵巢损伤的保护，目前临床使用的各种方法和药物均存在一定的局限性。白藜芦醇(resveratrol，RVT)是一种存在于葡萄、花生根茎和多种药用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有较强大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚，防止人体低密度脂蛋白氧化，清除自由基，并能改善修复卵母细胞损伤，改善卵母细胞质量，减轻氧化损伤所致老化和与年龄相关的疾病[2]。笔者所在课题组在前期的实验中研究证实白藜芦醇预防性应用对顺铂化疗后大鼠卵巢功能有一定的保护作用[3]。本研究拟在前期实验结果的基础上，基于PI3K/Akt/mTOR信号通路，探讨白藜芦醇改善大鼠的化疗性卵巢损伤的分子机制，以期为临床应用大剂量的化疗药物后所导致的卵巢储备减退，提供有效的保护方法和科学依据。

材料与方法

1.材料来源:实验动物：清洁级8周龄雌性Wistar大鼠，体质量180～200g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验室动物中心。实验室清洁级，室温20～25℃，相对湿度45%～55%。喂食无特殊病原体(SPF)级鼠饲料及净化水，每天光照12h，入笼1周后，每天按时行阴道涂片，显微镜下观察动情周期，选择有正常动情周期的30只大鼠入组实验。

2．实验试剂：顺铂冻干粉购自山东齐鲁制药有限公司；白藜芦醇购自上海祥弘生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体均购自美国 Cell Signaling Technology(CST)公司。BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PVDF 膜购自美国 Bio-Rad公司。

3．实验分组及处理：30只雌性Wistar大鼠采用数字表法随机分为3组，即对照组、化疗组(顺铂组)、化疗给药组(白藜芦醇+顺铂组)，每组10只大鼠。在21天的实验期间，对照组不给于任何药物处理，化疗组给予0.9%NaCl溶液1ml/d灌胃，按照前期实验已经筛选出药物的有效剂量，化疗给药组给予白藜芦醇25mg/(kg·d)溶于0.9%NaCl溶液1ml中灌胃。在实验第15天，除对照组外，其余两组大鼠均称重后，单次给予顺铂(5mg/kg)，用0.9%NaCl溶液稀释至2ml，注射入腹腔内[3]。

4.标本提取及检测：实验第21天，各组大鼠完成全部给药后24h，对所有大鼠进行麻醉，处死各组大鼠，取出双侧卵巢。(1)HE染色：4%甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，HE染色，在光镜下观察卵巢形态及卵泡发育情况。(2)TUNEL凋亡检测：切片常规脱蜡入水，加入Labeling Buffer混匀后将切片置于湿盒中，37℃温箱温育2h。抗体稀释液 1∶100 稀释生物素化地高辛抗体，TBS洗涤，DAPI染色液轻度复染，ddH2O水洗。抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察。每张片子随机选择5个视野进行计数阳性细胞和区域内的总细胞数量，计算阳性细胞所占百分比(%)，即调亡指数(apoptotic index, AI)。(3)Western blot法检测：卵巢组织蛋白提取，进行BCA蛋白定量，再行蛋白变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，封闭后分别行一抗孵育，二抗孵育后，将显影液按照比例配置，避光保存。于暗室中，将条带取出在吸水纸表面印干，将配置好的显影液按照一个条带200μl的量，均匀涂于膜上。根据说明书设置好曝光条件，曝光拍照。

结 果

1.各组大鼠卵巢组织病理学变化:对照组大鼠卵巢切片可见各级生长卵泡，黄体数目较多，血管丰富，间质腺少见。化疗组卵巢切片可见卵巢萎缩，各级卵泡数明显减少，黄体退化，间质区有不同程度的炎细胞浸润和纤维化。化疗给药组卵巢切片可见卵巢结构较化疗组有明显改善，可见卵泡总数增多，间质纤维化程度有所减轻，且可见一定数量的黄体,详见图1。

2.各组大鼠卵巢细胞凋亡比较：TUNEL凋亡试剂盒检查，绿色荧光点代表凋亡细胞，与对照组比较，化疗组荧光明显增强，荧光区域明显增大，且呈点线状分布，凋亡指数明显升高，差异均有统计学意义(F=4211.70，P=0.000)，表明造模成功。与化疗组比较，化疗给药组绿色荧光显著减弱，荧光区域减小，呈星点状分布，凋亡指数明显降低，差异均有统计学意义 (F=2180.32,P=0.000)。，详见表1、图2。

图1 各组大鼠卵巢组织结构(HE,×40)A.对照组；B.化疗组；C.化疗给药组

表1 各组大鼠卵巢细胞凋亡指数

与对照组比较，*P=0.000；与化疗组比较，#P=0.000

3.各组的大鼠卵巢组织中PI3K/Ak/mTOR的相关蛋白表达：与对照组比较，化疗组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表达则可见明显降低，差异均有统计学意义(p-PI3K/PI3K:F=328.44,P=0.000; p-Akt/Akt:F=471.04,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=398.72,P=0.000)；而与化疗组比较，化疗给药组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表达均可见明显增高，差异均有统计学意义 (p-PI3K/PI3K:F=161.52,P=0.000; p-Akt/Akt:F=391.08,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=185.00,P=0.000)，详见图3、表2。

图2 各组大鼠卵巢细胞的凋亡情况(TUNEL，×400)A.对照组；B.化疗组；C.化疗给药组

图3 各组大鼠卵巢组织中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达情况

讨 论

研究发现，组织形态学和生物化学方法能证明卵巢损伤，例如窦卵泡、闭锁卵泡计数和血清激素浓度测定[4]。笔者研究组在前期的研究中，通过检测各级卵泡数及血清抗苗勒管激素(AMH)成功造模DOR大鼠。在本研究中，笔者采用组织病理学、TUNEL凋亡和Western blot法检测白藜芦醇对大鼠化疗后卵巢损伤的保护及作用机制。研究结果发现，白藜芦醇可以减少化疗导致的卵巢细胞的凋亡，增加各级生长卵泡，并能增加化疗损伤大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达，提示白藜芦醇能改善顺铂化疗导致的大鼠卵巢损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

表2 各组大鼠卵巢组织中相关蛋白表达水平的比较

与对照组比较，*P=0.000；与化疗组比较，#P=0.000

近年来，随着化疗药物进一步研究开发，肿瘤和免疫性疾病的缓解和治愈率正在稳步提高。但化疗可能导致DOR，生育能力下降，甚至发生早发性卵巢衰竭 (premature ovarian failure，POF)。顺铂是目前临床中一种广泛应用的化疗药物，用于治疗大多数类型的癌症。研究发现，顺铂可促使人原始卵泡的破坏和卵巢颗粒细胞的凋亡，导致以AMH分泌减少、卵泡细胞凋亡增加以及动情周期紊乱等为特征的卵巢衰竭[5,6]。笔者经过前期造模实验的结果可得出，顺铂5mg/kg腹腔单次注射可造成Wistar大鼠卵巢受损，AMH血清水平降低，成功制备出卵巢储备低下的动物模型[3]。

近年来，在早发性卵巢功能不全的研究中，发现PI3K/Akt/mTOR信号通路不仅参与了卵母细胞生长的调控及发育卵泡的增殖和分化，还能调控颗粒细胞的增殖和凋亡[7]。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，分别由催化亚基p110和调节亚基p85组成。p110亚基具有Ser/Thr激酶和磷脂酰肌醇激酶活性[8]。Akt也被称为蛋白激酶B，当细胞受到细胞外信号刺激时，细胞外刺激信号依赖于肌醇脂质信号分子，经过细胞膜转换并转导到细胞核，PI3K活化产生PIP3，导致Akt转录，Akt一旦在细胞膜上被完全激活，就会引起信号转导通路的级联反应[9]。Pdk1是PI3K的主要调控信号，在小鼠卵母细胞中选择性敲除Pdk1可导致小鼠卵巢损伤，而mTOR通路通过直接或间接调控上游的Akt，参与细胞生长分化，促进卵泡发育增殖[10]。笔者在研究中发现顺铂腹腔注射后，大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达减少。提示顺铂可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性，进而导致卵巢细胞凋亡，卵泡生长闭锁。

白藜芦醇是一种多酚类，非类黄酮类抗氧化剂。它是在葡萄皮和高剂量红葡萄酒中发现的植物抗毒素[11]。它具有抗炎，抗氧化和抗衰老的作用，通过上调细胞中的抗氧化系统发挥抗氧化功能，也对自由基具有直接的破坏作用[12]。Banu等[13]研究了白藜芦醇对暴露于6价铬大鼠卵巢发育的影响，发现白藜芦醇处理显著增加卵母细胞总数，闭锁卵泡数目减少，并抑制了细胞凋亡以及卵泡从原始阶段向其他阶段的转变阶段，保护卵巢储备能力。Liu等[14]在一项白藜芦醇对大鼠年龄相关不孕症的影响的研究中，发现白藜芦醇能保护免受年龄相关的生育力变化，促进卵母细胞数量和质量的恢复，并保持了健康的卵泡数量。Chen等[15]研究发现白藜芦醇对衰老大鼠的卵巢储备有保护作用，使用白藜芦醇治疗的衰老大鼠有更健康的生长卵泡和更少的闭锁卵泡。Atli等[16]也研究证实了白藜芦醇能增加了发育卵泡，减少闭锁卵泡的数量，并能保护卵巢功能抵抗氧化损伤。这些研究发现支持白藜芦醇延缓卵巢衰老的假说。白藜芦醇的这些作用可能与端粒长度和端粒酶活性增加、生殖细胞功能障碍减少和SIRT1激活有关，白藜芦醇可活化SIRT1，同时可以通过激活AMPK和LKB1来调控mTOR的活性。

本研究中，笔者按照前期实验的基础，建立化疗性卵巢损伤模型，给予预防性使用白藜芦醇每日灌胃25mg/(kg·d)，连续给药21天，组织学病理证实了化疗给药组的卵巢结构较化疗组有明显改善，可见卵泡总数增多，间质纤维化程度有所减轻，且可见一定数量的黄体。TUNEL凋亡实验发现，与化疗组比较，化疗给药组中绿色荧光显著减弱，荧光区域减小，呈星点状分布，表明白藜芦醇有明显抑制化疗损伤性DOR大鼠卵巢细胞凋亡的作用。而Western blot法分析发现，经过白藜芦醇预处理，化疗后的卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显增多，提示白藜芦醇可解除顺铂的抑制作用，使PI3K/Akt/mTOR信号通路活性增强，发挥其抑制凋亡的生物学功能，阻止卵巢细胞过度的凋亡。

综上所述，本实验证实了顺铂腹腔化疗会破坏大鼠卵巢结构，增加卵巢细胞凋亡，显著降低各级生长卵泡的数目。而白藜芦醇的预防性使用，能够减轻顺铂对大鼠卵巢组织结构的破坏及其对卵泡生长过程的抑制作用，促进卵泡生长，增加各级生长卵泡数，其保护机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。