柑橘类胡萝卜素累积机制、分析方法及其加工稳定性研究进展

,*

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,湖北武汉 430064;2.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070)

柑橘栽培在我国已有4000年历史,我国因生态条件优越,种质资源丰富,市场需求量大,已成为柑橘的重要产地,大多柑橘品种在湖南、湖北、福建、浙江、重庆、江西等省市广泛栽培[1]。随着我国经济的高速发展以及人民生活水平的不断提高,消费者对柑橘鲜果的品质提出更高要求,香甜可口、营养均衡、色泽诱人的柑橘将更具市场竞争力。

类胡萝卜素是天然存在的一类脂溶性色素,可分为仅含碳氢化合物的烃类(胡萝卜素,carotene)和碳氢化合物的含氧衍生物(叶黄素,xanthophylls)。自然界存在的类胡萝卜素有700多种,它们由8个异戊二烯单元组成。类胡萝卜素广泛存在于植物体中,具有抗氧化、增强机体免疫力、缓解慢性疾病的功能[2-4]。柑橘体内至少含有115种类胡萝卜素,是天然类胡萝卜素的重要来源[5-6]。类胡萝卜素的组成与含量不仅直接决定着柑橘果实的外观与色泽,同时关系到柑橘果实的营养功能,是评价柑橘品质的重要评价指标[7-8]。柑橘品种决定其类胡萝卜素的组成,外界环境刺激干预类胡萝卜素的累积[9-10]。阐明柑橘类胡萝卜素的累积机制,可为柑橘栽培和品质提升提供参考。橙汁是柑橘的主要加工产品,柑橘果实原料的选择及其类胡萝卜素的加工稳定性对橙汁品质至关重要。本文总结了柑橘类胡萝卜素的合成途径及其累积影响因素,综述了类胡萝卜素组成解析方法及类胡萝卜素的加工稳定性研究进展,为后续的相关研究提供参考。

1 柑橘类胡萝卜素的合成途径

图1 柑橘常见类胡萝卜素合成途径Fig.1 The biosynthesis pathway of common carotenoids in citrus

类胡萝卜素在柑橘的质体中通过一系列缩合、去饱和、环化、羟基化和环氧化反应形成[11]。柑橘中主要类胡萝卜素合成途径如图1所示[12]。起始由2分子牛儿基焦磷酸经合成酶催化生成八氢番茄红素,进一步去饱和生成六氢番茄红素,再经两次脱氢及异构化形成全反式番茄红素。番茄红素的形成是类胡萝卜素合成的重要步骤,但大多数柑橘中未见番茄红素的累积,只在少数柑橘品种中累积[13]。番茄红素在β-环化酶和ε-环化酶的共同作用下分别形成β-胡萝卜素和α-胡萝卜素,这些类胡萝卜素结构均不含氧原子,统称为胡萝卜素(carotenes)。β-胡萝卜素和α-胡萝卜素经一系列的羟基化和环化作用形成含氧类胡萝卜素,这类物质统称为叶黄素(xanthophylls)。α-胡萝卜素在羟化酶的作用下生成在黄体素,β-胡萝卜素经羟基化生成β-隐黄质,再次羟基化的产物为玉米黄质。玉米黄质在环氧化、异构化、去饱和的作用下,逐步形成其下游产物:紫黄质、9-顺式-紫黄质、黄体黄质、花药黄质等。9-顺式-紫黄质最终在双氧酶的作用下裂解形成脱落酸,为类胡萝卜素合成途径的最终产物[14]。

八氢番茄红素、六氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素是仅含碳氢元素的异戊二烯长链,而黄体素、β-隐黄质、玉米黄质、紫黄质、9-顺式-紫黄质、黄体黄质、花药黄质等含有游离羟基及环氧结构、含羟基的类胡萝卜素通常与脂肪酸结合形成酯化物[13-15]。通过气相色谱(GC)分析,饱和脂肪酸癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)是柑橘里面常见的与含氧类胡萝卜素形成酯化态的脂肪酸[16],不饱和脂肪酸棕榈油酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)也曾在柑橘中有所报道[17]。在植物组织中,酯化态的形式更有利于类胡萝卜素的贮藏稳定性,但酯化形式降低了类胡萝卜素的溶解性,进而降低其生物利用率[17]。

2 遗传因素对柑橘类胡萝卜素累积的影响

遗传因素决定柑橘果实类胡萝卜素的积累,其在不同品种和组织间差异十分显著[18]。依据类胡萝卜素的累积差异,柑橘品种可大致分为四类:富含β-隐黄质类、富含紫黄质类、富含八氢番茄红素类和类胡萝卜素低累积品种[19]。大多数宽皮柑橘,包括南丰蜜桔和椪柑(C.reticulataBlanco)的果实中富含β-隐黄质。甜橙(C.sinensis(L.)Osbeck ‘Trovita’)和脐橙(C.sinensis(L.)Osbeck ‘Washington’)的果皮和果肉中富含紫黄质。红葡萄柚(C.paradisiMacf.)和红肉脐橙(C.sinensis(L.)Osbeck Cara Cara)是红肉突变体,果肉中大量积累八氢番茄红素(番茄红素的前体)。其他品种,包括酸橙(C.aurantifolia(Cristm.)Swingle)、柠檬(C.limon(L.)Burm. f.)和柚子(C.grandis(L.)Osbeck)果皮和果肉中类胡萝卜素的含量较低[20]。

类胡萝卜素合成途径基因的调控直接影响柑橘类胡萝卜素的累积。Ikoma等认为β-隐黄质是六碳环羟基化的中间产物,上游基因的高表达(提供足够的β-胡萝卜素)和下游羟基化酶基因的低表达(只能使类胡萝卜素六碳环一侧羟基化)使得宽皮柑橘中β-隐黄质大量累积[21]。Kato等通过对比不同紫黄质含量累积的柑橘材料,发现剪切双加氧基因的表达量与紫黄质的累积显著相关[14]。Liu等以番茄红素累积品种“红安六”为实验材料,发现上游的八氢番茄红素、六氢番茄红素、番茄红素相关合成酶表达量高,同时下游的番茄红素环化酶的表达量降低,导致番茄红素及其前体物的大量累积[22]。八氢番茄红素合成酶是调节类胡萝卜素合成途径的上游限速酶[23]。柠檬在成熟阶段,果皮由绿色转变为黄色,果皮和果肉类胡萝卜素含量下降,无色类胡萝卜素是柠檬果实中的主要成分,比如尤里卡柠檬中六氢番茄红素占总类胡萝卜素的18%～22%,八氢番茄红素在里斯本柠檬中多达86%。无色类胡萝卜素(八氢番茄红素和六氢番茄红素)是白柚果实中的主要类胡萝卜素成分,此外还有少量的环状胡萝卜素(β-胡萝卜素、黄体素)[20]。柠檬和白柚着色能力弱的原因可能与介导无色类胡萝卜素向有色类胡萝卜素转化的基因表达量有关。通常柑橘类胡萝卜素含量的排序为:宽皮柑橘>杂柑>甜橙>柚类[20]。

果皮是柑橘类胡萝卜素的主要积累部位,往往柑橘果皮类胡萝卜素含量远高于果肉[24]。Rodrigo等[25]对Navelate柑橘成熟过程中橘皮的类胡萝卜素合成基因进行解析,发现一旦达到转色阶段,脱氢酶基因上调增强,生产更多的线性胡萝卜素进入下游合成通路。果皮脱氢酶基因表达量的上调可能是导致其类胡萝卜素的累积高于果肉的原因。

3 环境因素对柑橘类胡萝卜素累积的影响

3.1 温度对柑橘类胡萝卜素累积的影响

柑橘果实发育期间,类胡萝卜素累积的同时伴随着叶绿素的退化。与果皮相比,果肉中叶绿素的退化和类胡萝卜素的合成更早,导致果肉更早地变色[26]。如图2所示,红肉脐橙生长成熟过程中果肉的转色明显地早于果皮[13]。研究发现在叶绿素消退和类胡萝卜素累积的过程中,温度适宜的白天(20 ℃)和低温的夜晚(5 ℃)能使柑橘果实产生更好的色泽,当空气温度低于13 ℃时能引起叶绿素色素的消失,显示出类胡萝卜素明亮的橙色[27]。热带或亚热带地区由于日间平均气温较高,昼夜温差小,所以这些地区种植的柑橘类果皮仍然是绿色或浅橙色[27]。Dhuique-Mayer等对比地中海气候、亚热带气候和热带气候下种植甜橙的类胡萝卜素累积,研究表明鲜明的地理条件下,类胡萝卜素累积含量差异较大,地中海气候尤其增加了甜橙中β-隐黄质和顺式紫黄质的含量[28]。

图2 红肉脐橙生长及成熟过程中果皮和果肉色泽的变化Fig.2 Change of color of peel and pulp in Cara Cara fruit during growth and maturation process注:1～10数字对应实验的采样阶段,数字2、4、6和10对应未成熟-绿色期、成熟-绿色期、转色期和全色期。

Lu等对我国湖北、福建、重庆、江西和湖南等五大典型产区红肉脐橙类胡萝卜素累积进行统计研究,各产区红肉脐橙由于基因型相同,类胡萝卜素的组成在液相图谱上趋于一致,但类胡萝卜素含量存在差异[8]。具体而言,福建红肉脐橙总的类胡萝卜素含量最高,而湖南样品含量最低。研究发现红肉脐橙总类胡萝卜素含量与平均温度相关,高温明显有利于总类胡萝卜素含量的累积。然而,当平均温度超过21 ℃时,总类胡萝卜素含量将减少[27]。在这五大柑橘产区中,福建地区由于平均温度相对较高,适宜类胡萝卜素累积。

3.2 光照对柑橘类胡萝卜素累积的影响

研究表明,柑橘中含氧的叶黄质累积受光照强度的影响较大,在弱光条件下玉米黄质环氧酶(ZEP)基因表达量提高,有利于玉米黄质进一步环氧化形成紫黄质。随着光照强度的增加,紫黄质脱环氧酶(VDE)的基因表达量增强,使得紫黄质向玉米黄质转化[23]。Gao等对比了光照强度对红葡萄柚和血橙愈伤组织中类胡萝卜素累积的影响,结果表明光能调节柑橘愈伤组织中几种类胡萝卜素基因的表达,但可能不会导致类胡萝卜素产生明显变化[29]。Lu等对我国湖北、福建、重庆、江西和湖南等五大典型产区红肉脐橙类胡萝卜素累积,尚未发现光照时长与总类胡萝卜素累积的相关性[8]。

Zhang等认为植物对不同波长的光具有不同响应,用蓝光(波长470 nm)处理萨摩柑橘(Satsuma mandarin)、瓦伦西亚橙(Valencia orange)和里斯本柠檬(Lisbon lemon),增加了其中总类胡萝卜素含量,而用红光(波长660 nm)照射不影响其中类胡萝卜素的含量或组成,仅在里斯本柠檬中,红光略微增加了β-隐黄质的含量[30]。柑橘蓝光处理诱导类胡萝卜素积累比红光更有效。Bohne等发现,在莱茵衣藻中,蓝光有效上调PSY基因的表达,而红光照射对该基因的表达没有显著影响,同样的结果也在柑橘中得以证实[31]。

4 柑橘类胡萝卜素组分分析

柑橘中的类胡萝卜素分为仅含碳氢的胡萝卜素和含氧结构的叶黄素,其中叶黄素又以游离或者酯化的形式存在,叶黄素和脂肪酸经酯化酶或酰基转移酶的催化形成酯化物[32]。在水果成熟期间,叶绿体逐渐转变为有色体,同时游离类胡萝卜素色素逐渐减少,伴随叶黄素酯的增加。叶黄素的酯化形式丰富了天然类胡萝卜素的多样性。皂化处理常被用于类胡萝卜素酯化物的水解,释放出对应的游离叶黄素,使类胡萝卜素成分简化,便于分析。柑橘中类胡萝卜素组成的研究主要集中在检测皂化后游离态类胡萝卜素[12,33],皂化过程可能导致类胡萝卜素结构破坏或异构[34]。Sagratini等发现皂化后橄榄中β-胡萝卜素的回收率降低[35]。同样,Divya等对比分析了香菜皂化前后的类胡萝卜素浓度,发现β-胡萝卜素在皂化过程中损失20%～30%,其他胡萝卜素损失50%[34]。研究表明,含0.02 mol/L KOH的甲醇或乙醇溶液能够达到最优的皂化效果,当KOH浓度增加时,游离类胡萝卜素的产量降低[36]。Chan等研究也证实,低浓度的KOH足以将酯化形式的叶黄素转化为自由形式[37]。乙醇/己烷(4∶3)是提取食品中类胡萝卜素最常见的萃取剂组合之一[38-40],也适用于柑橘类胡萝卜素的提取。类胡萝卜素碳链中的不饱和碳键容易受光、热、酸和氧的影响易发生氧化、异构化、环化、加氢、脱氢等,形成结构复杂的各类化合物[41]。BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)是目前使用最多的保护类胡萝卜素抗氧化剂[38]。

表1 柑橘中常见类胡萝卜素(游离和酯化态)的出峰顺序、紫外光谱特征和MS碎片信息Table 1 Elution order of carotenoids(free and esters)in citrus,along with their UV/Vis spectroscopy and mass spectrometry characteristics

续表

续表

类胡萝卜素游离态和酯化态的存在形式说明其化学结构的高度可变性,大大增加了类胡萝卜素分析的难度。标准品的缺乏以及某些类胡萝卜素的低浓度均增加了类胡萝卜素的分析难度。因此,柑橘类胡萝卜素组成缺乏充分的研究。目前,类胡萝卜素的鉴定通常借助于高效液相色谱串联大气压化学电离源质谱(HPLC-APCI-MS),将质谱信息与已发表的碎片离子丰度或质谱库进行比较。结合类胡萝卜素在YMCC30色谱柱上的出峰顺序、UV-Vis光谱特征(最大吸收峰、光谱结构、异构峰强度)、以及文献报道的质谱数据均能为类胡萝卜素的推断提供依据。UV-Vis光谱特征有利于类胡萝卜素异构体的推测,类胡萝卜素单顺式异构体的最大吸收与其对应的全反式结构相比蓝移2～6 nm,而双顺式异构会蓝移10～12 nm。除此之外,顺式峰能够在近紫外区检测到。类胡萝卜素酯化导致其分子量的增加,出峰顺序推后,而酯化不改变叶黄素的发色团特征,所以应用它们的UV-Vis紫光谱特征不发生改变[15]。酯化态的叶黄素在MS中能获得固定的裂解途径。在单酯化物中,碎片离子[M+H-18]+、[M+H-FA]+和[M+H-FA-18]+能够清晰地获得,它们分别对应水、脂肪酸以及水和脂肪酸共同的丢失。在二酯化物中,单个脂肪酸从质子化分子离子的丢失([M+H-FA1]+、[M+H-FA2]+)及两个脂肪酸和水的共同丢失([M+H-FA1-FA2]+、[M+H-FA1-FA2-H2O]+)均能清晰地检测到[17]。类胡萝卜素的定量通常是基于峰面积与含量之间的线性关系。由于类胡萝卜素成分的复杂性,没有足够多的类胡萝卜素标准品用于定量分析,通常情况下用一种或者多种现有的类胡萝卜素标品来定量结构相近的类胡萝卜素。柑橘中常见类胡萝卜素(游离和酯化态)的出峰顺序、紫外光谱特征和MS碎片信息如表1所示[8,17,42]。区分柑橘类胡萝卜素的游离或酯化态,能够系统解析柑橘类胡萝卜素组成，并为柑橘的营养评价和贮藏加工提供参考。

5 柑橘类胡萝卜素加工稳定性

5.1 热处理对类胡萝卜素稳定性的影响

多烯链结构是引起类胡萝卜素不稳定的主要原因,易导致类胡萝卜素易被氧化或产生几何异构[40,43]。热、光和酸可促进反式类胡萝卜素异构化为顺式结构。类胡萝卜素的氧化取决于可用氧的浓度以及类胡萝卜素存在的理化条件,通常认为类胡萝卜素氧化的初始阶段是形成环氧化物[44],随后的裂解和脂肪酸氧化裂解的过程类似,生成一系列低分子量化合物,是类胡萝卜素裂解产生的异味的主要成分。

Lu等对红肉脐橙果汁和模拟体系连续热处理600 min,其中,总类胡萝卜素、β-隐黄质和β-胡萝卜素在橙汁和模拟体系中的热降解均符合双指数降解模型[45],如式1所示。双指数降解表明其中包含快速降解和慢速降解,可能是由于类胡萝卜素降解的可逆反应(异构化)和不可逆降解(挥发性产物或环氧化物)并存的结果。八氢番茄红素可能是红肉脐橙橙汁中最稳定的类胡萝卜素,相关结果在番茄中得到证明,并归结于基质的保护作用[46]。橙汁加热过程中番茄红素也相对稳定,仅有微量异构体形成。

yt=y∞+A1exp(-αt)+A2(exp)(-βt)

式(1)

式中,yt表示t时间类胡萝卜素实际浓度;y∞表示无尽时间时类胡萝卜素的理论浓度;A1和A2是实验系数;α和β分别表示一级反应快速降解和慢速降解常数。

类胡萝卜素的热稳定性受其分子形状、溶解度、疏水性、结晶状态等因素的影响[47]。番茄红素和β-胡萝卜素具有相同的分子量,但番茄红素在热处理过程中更具稳定性。据报道,具有线性分子结构的番茄红素可形成多分子层和聚集体以防止其结构的变化[47]。在番茄的加工制品中,研究者发现其中的番茄红素呈晶体形态,具有稳定性和不溶解性,能够抵抗进一步的降解或异构化[48]。与番茄红素相比,β-胡萝卜素分子的两端有两个苯环形结构,不易聚集成有序结构,相对不稳定[47]。β-隐黄质中羟基的存在增强了其在橙汁中的溶解度,可能导致其具有热不稳定性[45]。

Kobori等在番茄脱水模型系统中发现环境温度下类胡萝卜素的降解证明了挥发性成分和类胡萝卜素前体之间的关系,GC-MS分析得到的挥发性成分6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-辛烯-1-醛、2,3-环氧-香叶醛、橙花醛和香叶醛来自番茄类胡萝卜素的非酶氧化降解[49]。在氧气存在的条件下,热处理能使类胡萝卜素氧化降解,产生的挥发性成分多于非挥发性成分[50]。Kanasawud等探究了β-胡萝卜素的热降解过程,将β-胡萝卜素置于空气中,于97 ℃加热3 h,通过GC-MS对降解产物进行分析,推测β-胡萝卜素首先与氧反应形成5,6-环氧-β-胡萝卜素,再转化成5,6,5′,6′-二环氧-β-胡萝卜素、柠黄质或黄体黄质;黄体色素又可进一步通过环氧重排转化成金色素,然后可能断链形成二氢猕猴桃内酯[51]。

5.2 光照对类胡萝卜素稳定性的影响

光照可导致类胡萝卜素降解,其降解产物被认为是类胡萝卜素自由基阳离子[50]。激光显著影响类胡萝卜素稳定性,β-胡萝卜素在氯仿中经激光照射后能快速漂白,其可能的机制是:光能激发β-胡萝卜素分子,与溶剂反应形成类胡萝卜素-溶剂自由基加合物或β-胡萝卜素自由基。β-胡萝卜素分子在激发态可能回到基态,基态的类胡萝卜素也可能受到在上述反应中产生的自由基副产物的攻击,并经历较慢的降解过程形成β-胡萝卜素自由基阳离子[50]。橙汁在贮藏销售等供应链环节,不可避免受到光照的影响,其降解产物可能是类胡萝卜素自由基阳离子、挥发性成分等[52]。Pesek等将果蔬汁进行光照(2476 Lux),番茄红素的降解速率大约是α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的光降解速率的1/5,三者的降解速率常数分别为0.061、0.273和0.309/d。在这个光照体系中明显检测到黄色减弱,可能与α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的降解有关[53]。Lee等对番茄红素的模拟体系进行照射,结果表明番茄红素的光降解满足一级动力学方程,番茄红素异构体是光照的主要产物[54]。

5.3 pH对类胡萝卜素稳定性的影响

类胡萝卜素暴露于酸性条件下可以产生离子对,然后解离形成类胡萝卜素阳离子[50]。这个过程详见式2:

Car+AH↔(CarH+A-)↔CarH++A-

式(2)

β-类胡萝卜素、8′-阿朴-胡萝卜素-8′-醛的阳离子光谱变化在苯、二氯甲烷溶液中有所报道。其中8′-阿朴-胡萝卜素-8′-醛能够被硫酸(pH3～3.5)降解。研究表明酸性条件下热处理能使5,6环氧类胡萝卜素发生分子重排,生成5,8环氧类胡萝卜素[55]。红肉脐橙橙汁呈天然的酸性,这种酸性环境易引起环氧结构类胡萝卜素及对应酯化物的热不稳定性[45]。

5.4 金属离子对类胡萝卜素稳定性的影响

研究表明,具有氧化作用的金属离子(铜、铁、锌、铝等)可直接与类胡萝卜素发生相互作用,导致其降解[56]。在迄今为止完成的大部分工作中,三氯化铁是常用的铁氧化剂,用于研究铁离子对类胡萝卜素的降解作用[57]。铁离子可导致类胡萝卜素降解形成多种产物,如角黄素、8′-阿朴-胡萝卜素-8′-醛、乙基-8′-阿朴-胡萝卜素-8′-乙酸乙酯、7′-阿朴-7′,7′-二氰基-β-胡萝卜素和乙基-6′-阿朴-胡萝卜素-6′-乙酸乙酯等。类胡萝卜素与铁离子的相互作用如式3所示:

Car++Fe3+↔Car·++Fe2+

式(3)

通过光谱特征和伏安法确定了该反应形成的类胡萝卜素阳离子自由基和亚铁离子含量。这个反应可以发生在没有光照的条件下,但用近紫外线照射可以增加反应速率[56-57]。当光线存在时,类胡萝卜素和三氯化铁反应可以再生上述等式的三价铁离子,再生的三价铁离子继续与剩余的中性类胡萝卜素反应或与式3中产生的类胡萝卜素阳离子自由基发生反应,反应过程如式4所示:

Car·++Fe3+→Car2++Fe2+

式(4)

类胡萝卜素二价阳离子的产生可能与铁离子的浓度有关。随着三价铁离子含量的增加,自由基阳离子逐渐产生。当加入更多的氯化铁,二价阳离子类胡萝卜素进一步产生。中性类胡萝卜素向类胡萝卜素二价阳离子或类胡萝卜素阳离子自由基转化过程中,其吸收光谱发生变化。三种物质的λmax的排序为:中性类胡萝卜素<类胡萝卜素二价阳离子<类胡萝卜素阳离子自由基[50]。

6 结语

柑橘品种决定其中类胡萝卜素的组成,外界生长环境干预柑橘类胡萝卜素含量累积。因此,不同产区种植同品种柑橘的类胡萝卜素组成一致,但含量累积存在差异。橙汁是柑橘加工产品,橙汁加工和供应过程的环境因素,不可避免地影响类胡萝卜素的稳定性。综合分析,目前的研究进展归纳了柑橘类胡萝卜素的累积机制、分析方法及其加工稳定性研究进展。尚存在一些问题有待深入探讨:柑橘类胡萝卜素组成复杂,尤其是酯化成分标品缺乏,常采用皂化处理或者相对定量,可能造成含量计算不准确。环境对类胡萝卜素累积的影响因素很多,尚无统一的标准去量化环境因素对类胡萝卜素累积的影响程度。热处理是橙汁加工常用手段,大量研究集中探讨橙汁类胡萝卜素的热稳定性。其它环境因素如光照、金属离子对类胡萝卜素稳定性研究较少,并且大多探讨光照、金属离子对类胡萝卜素纯品的影响,涉及果汁体系的相关研究相对匮乏,有待进一步研究。