子宫内膜异位症患者月经血中PR-B基因甲基化状态无创检测

沈芳华 吕弘道 王利明 赵瑞珩

苏州市第九人民医院(南通大学附属吴江医院)(215200)

子宫内膜异位症(简称内异症)是育龄妇女常见疾病，是妇女痛经、盆腔痛、不孕的首要原因[1]，但病因和发病机制尚未明确[2]。“经血逆流”为最经典也是被广泛接受的病因学学说，可是90%以上妇女出现经血逆流，却只有10%妇女发生内异症。目前认为，内异症的发生与发展可能是遗传、环境以及表观遗传学等相互作用的结果[3]。目前研究[4-5]已发现，内异症患者中异位和在位内膜中孕激素受体B亚型(PR-B)的表达明显低于正常内膜，且存在PR-B异常甲基化。月经血中含有子宫内膜碎片，可从月经血中检测到DNA甲基化模式，通过月经血获取子宫内膜碎片具有简单、可靠、无创等特点。因此本研究通过检测内异症患者异位、在位内膜及月经血中内膜碎片PR-B的甲基化状态，探讨疾病的发生机制并探索疾病新的无创诊断方式。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2016-2017年本院因卵巢子宫内膜异位囊肿行保守性手术治疗、术后病理组织学诊断为内异症患者40例作为异位组，收集其异位、在位内膜组织和手术后第一次月经来潮的月经血。同时收集同期因输卵管因素不孕行宫腹腔镜检查(排除生殖道性传播疾病、盆腔子宫内膜异位症，宫腔镜下子宫内膜无明显病变)患者的子宫内膜和术后第一次月经血18例作为对照组。所有手术获取组织时间均在月经干净后5～7天进行。异位组患者年龄(33.3±4.5)岁(24～42)岁，月经周期均规则, 术前6个月未使用激素类药物或宫内节育器；对照组年龄(32.6±3.3)岁(27～39)岁，两组年龄无差异。本研究经本院伦理委员会审批，两组对象均签署知情同意书，同意其标本用做实验研究。

1.2 实验方法

1.2.1月经血收集月经第二天时阴道置入卫生棉条，6h后取出并置入50ml离心管(离心管底部放置一支架防止棉条坠入底部)，加入1.2ml生理盐水，1000g离心10min，取沉淀放入-80℃冻存备抽提DNA。

1.2.2DNA的提取和亚硫酸盐修饰两组样品用美国QIAGEN公司的DNA微量提取试剂盒提取获得DNA，按照说明书标准步骤逐步提取，最后得到的DNA经紫外分光光度计测定浓度后行DNA亚硫酸盐修饰(试剂盒购自北京天漠公司)，按照说明书标准步骤进行，具体操作步骤参考有关文献[7]。

1.2.3样品PR-B甲基化的检测用甲基化荧光定量PCR方法分别检测异位组异位内膜、在位内膜、月经血，以及对照组子宫内膜及月经血中PR-B的甲基化状态。PR-B的甲基化特异性引物序列参考文献[6]，Taqman探针由软件PRIMER3.0设计，引物和探针由上海生工合成。PR-B甲基化特异性引物序列为MF：5’-TGATTGTCGTTCGTAGTACG-3’，MR：5’-CGACAATTTAATAACACGCG-3’， Taqman探针序列为5’-6FAM-CAATCCCTCGCTAAATTCCA-BHQ1-3’。内参的引物序列为F：5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’，R：5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’， 内参探针序列为：5’-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3’。扩增使用ABI7300 Real Time PCR仪器进行，反应体系为20μl，其中水6.2μl，样品1μl(40ng)，引物(10 uM/μl)各0.9μl，探针(5uM/μl) 1μl，2×HoTaq Master MIX 10μl。反应条件为50℃×2min、95℃×10min、95℃×15 s、60℃×1min，循环数55个。荧光值的检测在60℃末尾处，检测3个副孔的读数取平均值，阳性对照采用的是甲基化标准品DNA，阴性对照为水。检测各样品和阳性对照的CT值，使用ΔΔCT法计算出甲基化率，甲基化率>4时认为PR-B甲基化状态阳性[7-8]。

1.3 统计学处理

用SPSS19.0处理数据, 用χ2检验和Spearman相关性分析。P<0.05时有统计学差异。

2 结果

2.1 PR-B的甲基化状态

研究结果显示，异位组异位内膜、在位内膜和月经血中存在PR-B基因启动子区域的甲基化状态，40例中有PR-B甲基化状态27例(67.5%)，在位内膜中有PR-B甲基化状态22例(55%)，月经血中有PR-B甲基化状态19例(47.5%)。对照组内膜中存在PR-B甲基化状态4例(22.2%)，月经血中存在PR-B甲基化状态3例(16.7%)。见图1(1724页)。

2.2 各组PR-B的甲基化状态占比比较

异位组中异位内膜(67.5%)、在位内膜(55%)和月经血中(47.5%)PR-B的甲基化状态阳性率无差异(均P>0.05)。对照组子宫内膜(22.2%)和月经血中( 16.7%)PR-B的甲基化状态阳性率也无差异(P=1.000)。异位组在位内膜(55%)和月经血中(47.5%)PR-B的甲基化程度高于对照组子宫内膜(22.2%)和月经血(16.7%)(χ2=5.393、5.013，P=0.020、0.025)。Spearman相关性分析，异位组在位内膜与月经血、对照组子宫内膜与月经血PR-B的甲基化状态均呈正相关(r=0.446、0.478，P=0.004、0.045)。见表1。

表1 异位组和对照组中PR-B的甲基化状态比较

3 讨论

3.1 内异症中PR-B的异常表达与DNA甲基化

内异症的发病机制虽未明确，但可以肯定内异症是一种激素相关性疾病。正常子宫内膜组织中PR-B的表达随着月经周期而呈周期性变化，增生期持续上升至增生晚期达最高值，分泌期开始减少至月经的第2 ～ 8天，PR-B几乎检测不到[9]。研究发现内异症异位内膜和在位内膜中增生晚期的PR-B的表达较正常内膜下降[10]。越来越多研究也证实，内异症可能是一种表观遗传学疾病。DNA甲基化是表观遗传学最常见的一种修饰模式[11]。DNA甲基化与基因的转录相关, 当基因甲基化程度越高其基因表达越低[12]。目前研究发现在内异症中存在许多表达异常的基因，这些异常可能与DNA的异常甲基化相关[13]。先后在HOXA10、h MLH1、E-cad、SF-1、PR-B等基因的研究中均发现存在异常甲基化模式[14-16]。Shen等[4]在内异症中发现异位内膜中PR-B的表达明显下调，并下调与其启动子区域的甲基化相关。吕艳文[5]等在内异症中发现在位内膜中PR-B的表达明显下调，且下调与其启动子区域的甲基化相关，认为PR-B异常甲基化导致的异常表达可能是内异症的重要调控机制之一。本研究结果也显示：内异症异位、在位内膜中PR-B基因启动子区域存在着甲基化状态，且在位内膜中PR-B的甲基化状态阳性率高于对照组子宫内膜。提示内异症中PR-B的高甲基化导致了PR-B的低表达， PR-B的低表达使孕激素对抗高雌激素的能力下降，也使PR-A的表达相对较高而进一步抑制PR-B活性，高雌激素大大提高了内膜细胞增殖能力，导致了内异症的发生发展。

3.2 内异症患者月经血中的PR-B异常甲基化

由于内异症早期诊断困难，临床缺乏高特异性和敏感性的生物学标记物[17]，很多患者就诊时已处于重度。寻找有效无创的早期诊断方法是临床急切解决的问题。文献报道[18]月经血中存在着子宫内膜碎片细胞，基于“经血逆流”学说和“在位内膜决定论”，认为月经血可用于内异症发生的病理学研究，很可能成为一种无创诊断的新方式。月经血中包含有子宫内膜脱落碎片，而甲基化状态不受月经周期影响，因此基因组甲基化信息也保持完整，并能准确反映子宫内膜细微变化，可作为检测子宫内膜基因异常甲基化的无创标本来源。Guo等[19]对月经血中脱落的子宫内膜细胞研究发现，与正常妇女相比内异症患者ER-β基因启动子区CpG岛呈低甲基化状态。本研究结果显示，异位组月经血中PR-B的甲基化率高于对照组月经血，在位内膜与月经血中PR-B的甲基化状态以及对照组子宫内膜与月经血中PR-B的甲基化状态均呈正相关，可见月经血的内膜碎片保存了在位子宫内膜中基因组甲基化信息。由于在位子宫内膜获取需要行诊刮活检等有创检查，而月经血的获取简单、方便、经济、无创，因此提示可通过月经血获取子宫内膜中异常甲基化模式，甚至可以对月经血进行全基因组的异常甲基化筛查来进一步探讨该疾病的发生机制，寻找新的诊断标记物和新的治疗方式。

综上所述，子宫内膜中PR-B的异常甲基化参与了内异症的发生，而这种异常甲基化可从月经血内膜碎片中检测出，这为探讨内异症新的无创诊断和治疗提供了新思路。