法尼基转移酶抑制剂和香叶基香叶基转移酶抑制剂对皮肤角质形成细胞增殖的抑制作用

周 宏，李名聪，顾亚男，朱婷婷，罗 欣，张胜权

皮肤覆盖于人体表面，是人体最大的器官之一。皮肤由表皮和真皮两部分组成，其中表皮的关键功能是在生物体和外界之间形成屏障，对人体有重要的保护作用。皮肤角质形成细胞(keratinocytes, KCs)是表皮的主要组成部分[1]。甲羟戊酸途径是细胞重要的代谢途径，其通过合成甾醇类异戊二烯(如：胆固醇)和非甾醇类异戊二烯在多种细胞过程中起关键作用[2]。甲羟戊酸途径的中间产物及终产物包括：甲羟戊酸(mevalonic,MVA)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)、胆固醇(cholesterol,CH)等[3]。胆固醇是细胞膜系统的组成成份，在体内可进一步转化成重要的生理活性物质,如胆汁酸、类固醇激素及维生素D(vitaminD，VitD)[4]。FPP和GGPP可以提供异戊烯基给小G蛋白的脂化过程，通过活化蛋白来影响细胞代谢途径[5]。研究[6-7]表明法尼基转移酶抑制剂 (farnesyltransferase inhibitor,FTI)-277和香叶基香叶基转移酶抑制剂(geranylgeranyl transferase inhibitor,GGTI)-298的组合模拟了他汀类介导的细胞外调节蛋白酶(extracellular regulated protein kinases5,ERK5)激活内皮保护机制。香叶基香叶醇能够阻断细胞凋亡，香叶基香叶基化参与了蛋白质的凋亡途径[8-9]。现使用FTI-277和GGTI-298作用于KCs，初步探讨其对KCs增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验试剂从外科手术获得的皮肤中分离出KCs；M154CF 培养基、Coating Matrix基质、胎牛血清、DMEM培养基和neutral protease(中性蛋白酶)(美国Gibco公司)；青霉素链霉素溶液、RIPA裂解液和细胞周期试剂盒(上海碧云天生物公司)；MTS试剂盒及抑制剂FTI和GGTI(美国sigma公司)；CyclinB1、CyclinE及β-actin(美国abcam公司)；P21、p-AKT、p-ERK1/2(美国Santa Cruz公司)；所有使用的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 在无菌条件下，用70%乙醇漂洗手术中取得的患者包皮组织。在无血清的培养基清洗数次以去除表面细菌。用已高温灭菌的镊子和剪刀将皮肤组织剪成多个小块，反复用无血清的培养基冲洗数次，转移至中性蛋白酶中，4 ℃消化过夜。第2天取出充分消化的皮肤组织剥离表皮层，加入0.025%胰蛋白酶消化5 min。然后用无菌注射器钝头在200目细胞筛上研磨，用无菌无血清的培养基反复冲洗，将所得液体离心，用M154培养基缓慢吹打形成KCs悬液，在细胞培养瓶中接种，37 ℃、5% CO2恒温恒湿细胞培养箱内培养。

1.2.2细胞活力测定实验(MTS) 在96孔板中预先铺上Coating Matrix，再接种KCs细胞(0.025%胰酶消化收集)，每孔100 μl(6×104/ml)，均匀铺板，直到细胞密度达到70%～80%，分别加入药物FTI(使终浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)、GGTI(使终浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)，同时设置对照组(0 μmol/L)。2 d后，每孔加20 μl MTS试剂混匀，37 ℃、5% CO2孵育3～4 h后，酶标仪检测在490 nm处的吸光度，实验重复3次。

1.2.3细胞周期检测 在6孔板中预先铺上Coating Matrix，再接种KCs细胞(0.025%胰酶消化收集)，密度为5×104/ml，孵箱中孵育，直到细胞密度达到70%～ 80%，分别加入药物：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并设置对照组(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs(0.025%胰酶消化)，室温下，按照细胞周期试剂盒的说明书操作，避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期，Flowjo软件分析细胞周期，实验重复3次。

1.2.4Western blot检测蛋白P21、CyclinB1和CyclinE的表达 在24孔板(2×105/孔)中预先铺上Coating Matrix，再接种KCs细胞(0.025%胰酶消化收集)，直到细胞密度达到70%～80%，分别加药：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并设置对照组(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs细胞(0.025%胰酶消化)，从细胞中提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，配制适当浓度的胶，每孔加入10 μl上样，然后电泳，恒压60 V电泳45 min，加压到120 V恒压电泳1 h，转膜(恒流300 mA，1.5 h)，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗(CyclinB1、CyclinE及β-actin浓度1 ∶1 000，P21、p-AKT、p-ERK1/2浓度1 ∶500)孵育2 h，洗膜，常温摇床孵育二抗(浓度1 ∶10 000)2 h，用Thermo Super Signal West Trial Kit化学发光底物显影，分析目的蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 FTI和GGTI能抑制KCs增殖随着FTI、GGTI药物浓度的增加，细胞活力呈下降趋势，当FTI药液浓度为5 μmol/L、GGTI药液浓度为5 μmol/L时KCs细胞相对活力最小，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图1A。KCs细胞分别被FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)单独处理时，FTI处理组的KCs细胞活力为85.3%，GGTI处理组的KCs细胞活力为75.5%，FTI和GGTI均能抑制KCs细胞增殖，抑制率分别为14.7%、24.5%(F=305.418，P<0.01)，与空白对照组相比差异有统计学意义。见图1B。

图1 FTI和GGTI单独处理对KCs增殖抑制作用A：不同浓度的FTI、GGTI单独作用KCs细胞2 d后对细胞增殖的影响；B：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)单独处理KCs后对其增殖影响；与空白对照组比较：**P<0.01

2.2 FTI和GGTI对KCs细胞周期G1期的阻滞效应不明显FTI、GGTI单独处理KCs细胞时，对细胞G1期阻滞作用均不明显。见图2。

2.3 GGTI、FTI单独处理KCs对细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE和P21表达的影响GGTI单独处理KCs后，与空白对照组相比，GGTI加药组CyclinB1表达下调(F=358.748，P<0.01)，CyclinE的表达上调(F=16.684，P<0.05)；同时FTI单独加药组CyclinB1表达下调(F=15.065，P<0.05)，CyclinE的表达上调(F=78.880,P<0.01)；GGTI、FTI单独加药组均能上调P21的表达(F=348.004，P<0.01)，与空白对照组比较差异有统计学意义。见图3A、B。

图2 流式细胞术检测细胞周期

图3 FTI和GGTI单独用药对KCs细胞周期蛋白表达的影响A：各加药组对KCs细胞周期蛋白的影响；B：各加药组蛋白表达的灰度分析；a:空白对照组;b:GGTI加药组;c:FTI加药组；与空白对照组相比较：*P<0.05,**P<0.01

2.4 FTI、GGTI单独处理KCs对PERK1/2、PAKT表达的影响FTI、GGTI分别单独处理KCs后，PERK1/2的表达下调(F=89.980，P<0.01)，pAKT的表达上调(F=37.709，P<0.01)，与空白对照组比较差异有统计学意义。见图4A、B。

3 讨论

皮肤的屏障结构和功能对人体健康至关重要。表皮角质形成细胞的功能表明，皮肤在使全身生理适应不断变化的环境中起着重要作用[10]。甲羟戊酸途径对细胞影响重大，是细胞最重要的代谢途径之一[11]。甲羟戊酸激酶对KCs的增殖、分化、凋亡及相关信号途径有重要的影响[12]。

图4 FTI和GGTI单独用药对KCs信号途径蛋白表达的影响A：各加药组单独处理KCs对信号途径蛋白的影响；B：蛋白表达的灰度分析；a:空白对照组;b:GGTI加药组;c:FTI加药组；与空白对照组相比较：**P<0.01

本研究表明，FTI和GGTI对KCs的增殖有抑制作用，可能是在甲羟戊酸代谢途径中，FTI对FPP、GGTI对GGPP抑制下游反应进行，导致其积累上游产物MVA、FPP、GGPP，缺失下游产物CH，上游产物累积和下游产物CH缺失都可能引起细胞代谢紊乱。P21抑制细胞周期从G1/S期[13]，CyclinE过表达会停留在G1期[14]，降低CyclinB1阻滞细胞于G2/M期[15]。FTI和GGTI降低了CyclinB1的表达，与此同时CyclinE、P21的表达得到了增强。此外，MAPK是接受膜受体转换与传递的信号并将其带入核内的重要途径，在许多细胞增殖相关信号通路中具有关键作用。P13K-AKT参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节。从而探讨了MAPK和P13K-AKT两个代谢途径中KCs增殖的影响，分别单独补充FTI、GGTI这两种抑制剂，与空白对照组相比，均表现为pERK1/2下调且pAKT的上调。然而这两种信号途径相当复杂，其影响的具体方式和途径还有待讨论。

所以，FTI和GGTI对皮肤角质形成细胞的增殖均有抑制作用。根据本研究结果，推测甲羟戊酸代谢途径中胆固醇合成受到影响，破坏皮肤细胞正常增殖。本实验仅为体外细胞研究，可以此为基础，构建甲羟戊酸代谢途径相关基因的动物模型，通过体外和体内两角度来研究甲羟戊酸代谢途径紊乱对皮肤表型的影响及其相关分子机制的研究。