TRIM59在非小细胞肺癌中的表达、临床意义及与c-myc、CDC25A蛋白的相关性研究

李 琛，杨晓光，钱海红，陈丽萍，苏 菁，冯 萍，侯海军，张志华

据最新流行病学调查显示，2014年我国居民肺癌发病和死亡例数均位居第一位，严重威胁国民健康[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数的85%以上，其生长分裂增殖较慢，转移扩散较晚。近年来，尽管NSCLC诊疗手段不断提高，但其五年生存率仍较低。从分子生物学水平，寻找敏感度高、特异性强的标志物已成为NSCLC早期诊断、治疗评估和预后监测的研究热点，同时为肿瘤的放化疗、靶向治疗提供新的技术支撑[2-3]。

三结构域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)系TRIM蛋白超家族的重要成员之一，于2011年由Valiyeva et al[4]首次在小鼠前列腺癌症模型中证实其是致癌基因，在随后的研究中逐渐证实TRIM59在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程中发挥重要作用[5-7]。但TRIM59在NSCLC组织中的研究较少，且相关致癌机制不明确。该研究通过RT-PCR法和免疫组化法检测TRIM59基因和蛋白在NSCLC组织中的表达，分析TRIM59蛋白与NSCLC临床病理特征和细胞周期相关蛋白c-myc、CDC25A的相关性，初步探讨TRIM59的致癌机制，并结合生存时间的随访，为NSCLC的早期诊断、治疗和预后监测提供准确、可靠的生物学指标。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究共纳入2012年2月～2014年2月于河北北方学院附属第一医院病理确诊的NSCLC组织和正常肺组织标本各40例，同时收集患者完整的临床资料，本研究经该院伦理委员会鉴定批准。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1主要试剂和仪器 RNA逆转录试剂购自日本Takara公司；SYBR Green实时定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；TRIM59和GAPDH引物由生工生物(北京)有限公司设计合成；全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士罗氏公司；E2010、DEPC水购自美国Sigma公司；RNA逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司；兔抗人TRIM59单克隆抗体、兔抗人c-myc、CDC25A多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2RT-PCR法检测TRIM59 mRNA表达 提取总RNA并定量，反转录为cDNA。TRIM59引物，上游5′-CCTGTGTTTGAGATAGATTTAAGAGC-3′，下游5′-GCAACAAGGTGAGACCCAGT-3′；GAPDH引物，上游5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游5′-TCACACCCATGACGAACA-3′。

PCR反应试剂：SYBR Premix Ex Taq 5 ml，PCR forward primer 0.2 μl，PCR reverse primer 0.2 μl，ROX Reference Dye 0.2 μl，cDNA 模板100 ng，DEPC水共10 μl。轻柔混匀，离心。PCR反应体系，95 ℃孵育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，反应共进行40个循环；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s终止反应。荧光定量PCR实验数据处理使用2ΔΔCt法，计算各样本Ct平均值(Ct=Ctnetl-Ctl3actin)。其中，中位数以上为高表达，以下则考虑低表达。

1.2.3免疫组化法检测TRIM59的表达及判定 10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色，病理诊断。80 ℃烤箱烘烤30 min，脱水，内源性过氧化物酶灭活，高温高压水化修复；加入一抗(1 ∶ 400)50 μl，4 ℃冰箱中孵育过夜；加入二抗50 μl，DAB显色，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化，各级乙醇(70%、75%、85%、90%、95%、100%)逐次脱水，松节油透明和树胶行封片处理，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，光镜下观察。

应用半定量积分法，包括阳性细胞数占视野百分比与阳性强度，TRIM59、c-myc蛋白以细胞质中出现黄色、棕黄色为阳性表达，而CDC25A染色主要定位于细胞核，其中阳性细胞计分：≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。阳性强度：浅黄色计1分，黄色计2分，红褐色计3分。二者相乘计为总分，0分计为-，1～4分计为+，5～8分计为，9～12分计为，-为阴性，+为弱阳性，～为强阳性。

1.3 随访通过门诊复查、电话随访，时间为2018年11月30日。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测TRIM59 mRNA表达以TRIM59/GAPDH比值作为RT-PCR定量分析，与TRIM59 mRNA在正常组中的表达相比，NSCLC组中TRIM59 mRNA的表达水平明显升高，差异有统计学意义(t=2.901，P=0.002)。见图1。

图1 RT-PCR检测NSCLC组和正常组中的TRIM59 mRNA表达情况与正常组比较：*P<0.05

2.2 免疫组化检测TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表达与TRIM59、c-myc、CDC25A在正常组中阳性表达水平[15.00%(6/40)、10.00%(4/40)、17.50%(7/40)]相比，三者在NSCLC组阳性表达[72.50%(29/40)、67.50%(27/40)、60%(24/40)]明显升高，差异有统计学意义(χ2=31.775，χ2=35.419，χ2=28.916，P=0.000)。见图2。

2.3 NSCLC组织中TRIM59的表达与临床病理参数之间的关系NSCLC组中TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白的表达水平均与病变分化程度、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移相关(P<0.05)，而与年龄、性别无关(P>0.05)。见表1。

2.4 NSCLC组织中TRIM59的表达与c-myc、CDC25A蛋白表达的相关性NSCLC组中TRIM59蛋白的表达与c-myc蛋白表达呈明显正相关(r=0.451，P=0.000)，而与CDC25A蛋白的表达亦呈明显相关性(r=0.421，P=0.002)。

2.5 TRIM59蛋白的表达情况与NSCLC患者生存的相关性分析TRIM59阳性组患者5年死亡率为65.52%(19/29)，而阴性组患者为36.36%(4/11)，差异有统计学意义(χ2=15.275，P=0.000)；生存曲线结果显示，TRIM59阳性组中位生存期为29个月，而TRIM59阴性组为56个月，差异有统计学意义(χ2=10.275，P=0.003)。见图3。

图2 免疫组化检测正常组和NSCLC中TRIM59、c-myc、CDC25A的阳性表达 SP×200A：TRIM59在正常组中的阳性表达；B：TRIM59在NSCLC中的阳性表达；C：c-myc在正常组中的阳性表达；D：c-myc在NSCLC中的阳性表达；E：CDC25A在正常组中的阳性表达；F：CDC25A在NSCLC中的阳性表达

图3 TRIM59蛋白表达与NSCLC患者生存期的相关性

2.6 Cox回归分析Cox回归模型分析显示，TRIM59表达水平(P=0.002)、脉管浸润(P=0.001)、淋巴结转移(P<0.001)、肝转移和TNM分期(P<0.001)均是影响NSCLC患者预后的独立因素。见表2、3。

3 讨论

三结构域蛋白家族(tripartite motif，TRIM)是一个在进化中高度保守的基因家族，由70多个成员组成，参与了多种细胞的生长、分化、发育的过程，同时在细胞凋亡、炎症和免疫应答过程中亦发挥重要作用[8]。TRIM家族蛋白最显著的结构特征是包括一个环状结构域(really interesting new gene,RING)、一个或两个B-box结构域(B-box domain)和一个盘绕区域(coiled-coil domain)。RING结构域是半胱氨酸富集的锌离子结合域，具有广泛的泛素化酶活性；B-box结构域参与蛋白之间的相互连接；盘绕区域能够介导成员自身发生同源寡聚，参与蛋白链接[9]。

表2 NSCLC组织中TRIM59与c-myc蛋白表达的相关性

表3 NSCLC组织中TRIM59与CDC25A蛋白表达的相关性

TRIM59亦称为MRFI，位于人类第3号染色体上，属于C-XI亚家族成员， 除了继承高度保守的三段结构域外，在其C端还有一个涉及蛋白跨膜定位的TM 结构域，参与TRIM59的定位。TRIM59蛋白位于细胞内质网膜上，内含403个氨基酸残基，通过介导蛋白之间的相互作用，泛素化调控蛋白的稳定性，促进肿瘤细胞的无序化增殖[10]。研究[11]证实，TRIM59通过参与NF-κB和IRF3/IRF7介导的信号通路的活化，发挥免疫信号的负性调节作用。TRIM59参与SV40 Tag/p53/pRB和Ras/ERK/PI3K/AKT两种致癌信号通路，调控细胞周期S期的DNA合成，促进细胞分裂增殖，同时能上调细胞周期相关蛋白的表达，最终诱导肿瘤形成[12]。

c-myc是myc家族中的重要成员，能诱导细胞增殖，促进其永生化、去分化和功能转化，在多种肿瘤形成过程中发挥重要作用。CDC25A是CDC25家族中重要成员，能加速细胞由G1期进入S期，从而增加细胞DNA的合成，使癌细胞获得高增殖活性；同时能消除ATP锚定模序上Thr-14和Thr-15的磷酸化抑制，在细胞周期运转中发挥正性调控作用。

本研究从基因水平证实了在NSCLC组织中TRIM59 mRNA表达水平明显高于正常组织，免疫组化结果证实TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表达水平均明显高于正常组织，同时TRIM59、c-myc、CDC25A蛋白表达水平均与病变分化程度、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移情况密切相关，进一步相关分析表明TRIM59表达与c-myc、CDC25A均呈明显正相关，提示TRIM59表达的异常在NSCLC发生过程中发挥重要作用，且与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，其致癌机制考虑与诱导c-myc、CDC25A蛋白上调有关。Hao et al[13]研究证实TRIM59 mRNA在NSCLC组织中的表达水平显著高于正常肺组织，且与吸烟、病变分期相关；Zhan et al[14]报道了TRIM59蛋白在各种非小细胞肺癌细胞系中的表达显著上升，而siRNA诱导TRIM59的下降在G2期抑制细胞周期中显著抑制NSCLC细胞系的增殖和迁移，此外，TRIM59能影响许多细胞周期的蛋白质，包括CDC25C和CDK1的表达；国内薛栋 等[15]通过免疫组化法证实肝癌组织中TRIM59的表达明显高于正常肝组织，TRIM59异常表达与肝癌的发生及分化程度、分期相关，其致癌机制考虑与诱导Twist 表达上调和E-cadherin表达下调有关，以上研究均支持本研究结果。

本研究进一步通过随访证实，TRIM59阳性患者死亡率明显高于阴性患者，且TRIM59阳性表达患者生存期明显短于阴性表达者，表明TRIM59的表达水平可作为NSCLC患者的重要预后监测指标，同时Cox回归模型分析亦证实TRIM59表达水平是影响NSCLC患者预后的独立因素。