TiO2纳米管负载米诺环素的释放动力学研究

程佳蕙，吴雨峰，王泽华，高啟坤，吴明月,3

种植义齿已成为牙齿缺失的首选修复方法，但其仍存在有2%～3%的失败率，种植体周围炎被认为是口腔种植修复失败的主要原因之一[1]，因此如何提高钛种植体的抗菌性能，从而减少种植体周围炎的发生，成为当前研究热点。随着种植体表面改性技术的发展，在含纳米结构的钛种植体表面构建局部药物释放体系已引起广泛关注。TiO2纳米管(TiO2nanotubes, TNT)具有比表面积大、多孔且结构均一、排列整齐、底端封闭等特点，可作为吸附药物的良好载体[2]。该实验在钛表面制备出不同管径的含有盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride, MH)修饰的TNT涂层，检测MH载入不同管径TNT后的载药能力及缓释特征。为种植体表面抑菌涂层研究提供新方法，并为种植体周围炎的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂纯度99.99%钛箔片(北京中金研新材料科技有限公司)；丙酮、丙三醇、氟化铵(西陇化工股份有限公司)，MH、壳聚糖(上海科肽生物科技有限公司)，试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器LP6003D型直流稳压电源(深圳市乐达精密工具有限公司)；Sirion-200场发射扫描电镜(FESEM,美国FEI公司)；X射线光电子能谱仪(XPS,美国Thermo-VG Scientific公司)；傅里叶红外光谱(FTIR,美国Thermo-VG Scientific公司)；接触角测量仪(成德市成慧试验机器有限公司)；UV-1800紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 实验过程

1.3.1钛纳米管的制备 将钛箔片加工成直径15mm、厚度0.25mm的圆形光滑钛片，依次放入丙酮、75%无水乙醇、去离子水中，超声清洗各20 min。再放入电解液为含0.27 mol/L氟化铵的丙三醇溶液(丙三醇溶液与双蒸水的体积比为1 ∶1)中，采用阳极氧化法石墨接负极，钛片接正极，调节直流稳定电源电压为10、20、30V的条件下分别3 h，以制备管径30、70、120 nm的TNT。反应结束后将钛片取出，大量双蒸水清洗，干燥。

1.3.2实验分组 钛片组(A组)；30 nm TNT(B组)；70 nm TNT组(C组)；120 nm TNT(D组)。

1.3.2.1BCD组 制备1 g/L的MH溶液，然后将25 μl MH溶液移液到TNT表面并轻轻铺展以确保均匀覆盖，后置入冷冻干燥系统，在-45 ℃真空下冷冻干燥2 h，重复上述加载步骤，直至负载MH的量达到200 μg，在最后干燥步骤后，移取2 ml PBS快速冲洗表面以除去积聚在表面的药物。

1.3.2.2BCD-MH组 配制10 mg/ml壳聚糖(chitosan，CHI)溶液：1%(kg/L)CHI+0.8%Vol乙酸置于去离子水中，将TNT基底固定在旋转涂布机上, 将20 μl该聚合物溶液移液到钛纳米管表面,使CHI以转速500 r/min涂层到基底上，涂布15 s，重复4次，然后在室温中干燥。

1.3.3样品的表征 FESEM观察样品表面形貌，并通过观察其侧方断面测量TNT的高度；接触角测量仪分析材料表面亲水性：滴3 μl去离子水于钛片表面，持续10 s，采集液滴影像并检测；XPS、FTIR对样品成分进行分析；紫外分光光度计检测样品表面MH的释放曲线(将含有MH的样品置于12孔板中，并加入1ml磷酸盐缓冲液，放入温度为37 ℃的恒温摇床中，再分别于6、12、24 h、2、3、4～15 d取出200 μl释放液以检测其中MH的浓度，并重新加入200 μl新的PBS溶液)。

2 结果

2.1 钛基材表面形貌表征FESEM显示：光滑钛片为镜面状；钛纳米管为蜂窝状，管径分别约为30、70、120 nm左右。见图1。断面显示不同管径钛纳米管的高度一致，约为700 nm。见图2。

图1 光滑钛片及TNT的表面微观结构 ×30 000A：光滑钛片；B：30 nm TNT；C：70 nm TNT；D:120 nm TNT

2.2 载药纳米管表面形貌分析图3A为载药前TNT的表面形貌。当载入米诺环素后，纳米管管腔及之间的孔隙被药物充填，但管状形貌依然存在。见图3B。之后用CHI多层覆盖后,纳米管形貌消失，表面光滑平整。见图3C。可见CHI多层的覆盖起到了封堵纳米管管口的作用，从而避免药物的突释。

2.3 材料表面亲水性分析TNT组的接触角明显低于钛片组(Ti)，表现出良好的亲水性，且管径越大，接触角越小，亲水性越大。加载MH后的TNT亲水性降低，而覆盖CHI后，亲水性明显减小，证明了CHI成功覆盖TNT，差异均有统计学意义(F=433.014，P=0.00)。见表1。

表1 各样品表面接触角角度

2.4 XPS分析图4A、B分别为TNT载药前后的XPS谱图，结果显示载药后N、C、Cl元素较载药前均明显上升，这与MH的分子式相吻合，见图5。

2.5 FTIR检测图6A、B分别为TNT载药前后的红外光谱图，载药后，处于3 000 cm-1的谱带为苯环的特征谱线，1 498 cm-1为苯环骨架C=C的特征带，这与MH的结构式相吻合，见图5。

2.6 MH的加载量与释放曲线由图7可见：3组样品在24 h内突释较为明显，在前9 d，药物释放量逐渐增加，释放趋势基本一致，而后释放速度有所减慢，至13～15 d，释放量不再增加。侧面反映药物的加载量，随着管径的的增加30、70、120 nm钛纳米管，载药量分别为48.33、71.29、60.01μg。其中70 nm钛纳米管组载药量最高，整个释放过程较其它2组更为稳定，至第15天时仍有少量释放。

图2 TNT的断面结构 ×50 000A：30 nm TNT；B：70 nm TNT；C：120 nm TNT

图3 TNT载药后的表面微观结构 × 100 000A: 30 nm TNT；B：TNT内载入MH；C: 载药后TNT表面覆盖CHI多层

图4 XPS分析图谱A：TNT组；B：加载MH的TNT组

图5 MH化学结构式

图6 FTIR检测结果A：TNT组; B：加载MH的TNT组

图7 MH释放曲线

3 讨论

目前，提高钛种植体抗菌性能的方法主要有2类：① 通过物理和化学方法，构建种植体预防感染表面以减少菌斑的附着。② 构建种植体抗菌表面以杀灭细菌，研究[3]证实，后者的抗菌效果更为持续有效。近年来，通过纳米化修饰来进行钛种植体表面改性成为研究的热点内容。TNT具有优异的生物相容性，高比表面积，尺寸可控，是局部药物输送的良好载体。研究[4-5]显示，药物的载药量及缓释特征，涂层的抗菌效果及对细胞的功能作用随着纳米管管径的不同而变化,适宜管径的TNT能够载负较大的药物量，具备更佳的释放效应，增加成骨相关细胞的活性，并且可抑制细菌的粘附。然而目前对于TNT最佳管径的选择尚存争议，据此，本实验采用阳极氧化法构建管径分别为30、70、120 nm的TNT。SEM观察呈特有的蜂窝管状结构，其断面高度一致，约700 nm。

大量研究[6]表明，防止细菌在种植体表面黏附是预防感染的关键。抗生素全身应用存在生物利用度差，选择性不足，细胞毒性等缺点，为解决上述问题，将抗生素载入纳米管腔，以降低细菌浓度、阻止细菌粘附到种植体表面来防止相关感染[7]。本实验使用的抗生素为MH，显著作用于兼性厌氧菌和厌氧菌，抗菌谱广、耐药菌株少，能杀死种植体周围的致病菌并抑制细菌粘附到种植体表面[8]。其作用机制是防止细菌蛋白质合成而发挥抗菌作用，抑制牙周组织胶原酶活性，减少牙槽骨吸收[9]。研究[10]显示，MH对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等种植体周围炎优势菌的最小抑菌浓度为0.25 μg/ml。因此，本研究采用TNT为基材将MH加载至纳米管表面，通过XPS及FTIR检测，证实实验组样品表面成功加载MH。

尽管TNT是吸附药物的良好载体，但载入管腔中的抗生素会产生早期突释现象，造成局部药物浓度降低至最低杀菌浓度而引发感染，而过高抗生素浓度也会导致细胞毒性反应[11-12]。据此，本实验将CHI多层覆盖到负载MH的TNT表面，封堵TNT管口，以达到MH的控制释放。SEM显示纳米管形貌消失，表面光滑平整。CHI为N-乙酰葡萄糖胺单体构成的聚合物，是一种天然阳离子多糖。可与各种生物活性材料结合使用，具备无毒性，生物降解性，抗菌活性及良好的成膜性能等，广泛应用于生物工程和再生医学等领域[13]。

为比较不同管径的缓释效果，本实验进行了MH的释放动力学测定，由释放曲线可见：70 nm TNT组的载药量最高，至15 d仍有少量释放，其次为120 nm TNT组、30 nm TNT组。由以上规律可知，当TNT管径较小时，会阻止药物分子进入管腔内部而使载药量降低，而管径过大，钛纳米管的比表面积降低，载药量反而下降。

因此，本研究在钛表面制备出不同管径的含有MH修饰的TNT涂层，实现米诺环素的有效荷载，并涂覆CHI多层膜构建缓释系统，检测米诺环素载入不同管径TNT后的载药能力及缓释特征，其中，70nm管径的TNT的载药量最大，缓释效果最好，为种植体表面抑菌改性及种植体周围炎的防治提供新的方法与思路。