IGFBP-3在大鼠心肌纤维化和心肌成纤维细胞活化增殖中的表达

宋剑南，陶 辉，丁季飞，徐盛松，石开虎

心肌纤维化是指在多种病理性因素刺激下心肌组织细胞外基质中心肌胶原过量沉积及比列失调为主要表现的一种病理性过程，在房颤、心衰和心肌病等多种心脏疾病中普遍存在，但其发生发展机制迄今仍不明确[1-2]。其中，心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)的活化增殖使心肌间质中胶原沉积，其作用在心肌纤维化的病变发生发展中十分关键[3]。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP)是一组与体内胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)结合对细胞多种生物学效应产生影响的关键性分子蛋白。其中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)是IGFBP系列中最主要的一种，在体内循环中占很高的比例，是IGFs的主要结合受体[4]。研究[5-6]表明，IGFBP-3与一些器官的纤维化有关，特别在肝纤维化中常有相关报道，但在心肌纤维化的病变中的研究报道甚少。现通过建立相关的动物和细胞模型，检测IGFBP-3在大鼠心肌纤维化和CFs活化增殖中的分子表达，分析其在心肌纤维化病变过程中起到相关的促进或抑制作用，从而为IGFBP-3在心肌纤维化的诊断与治疗提供新的依据，并探索心肌纤维化可能的发病原理与机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 在同样环境下给予相同且足够的水和饲料喂养动物，选40只6周左右SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±30)g；40只约10 g的清洁级SD乳鼠，由安徽医科大学实验动物中心选购，动物许可证号：scxk(皖)2017-001。

1.1.2药品与试剂 盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)(上海禾丰制药有限公司，批号：41170302)；转化生长因子-β1(Peprotech，美国)；CCK-8试剂(Sigma公司，美国)；Western blot技术相关的一、二抗(Bioworld Technology公司，美国)；逆转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3主要仪器 EPS电泳仪(上海天能科技有限公司，中国)；PCR仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；Western blot 技术相关的显影设备；高速冷冻离心机(Eppendorf 公司，德国)，CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物分组和纤维化模型的构建 40只雄性SD大鼠随机均分为对照组和模型组。在相同饲养环境下，模型组每天腹部皮下注射ISO(5 mg/kg)，连续注射2周，建立SD大鼠心肌纤维化模型。对照组连续注射2周予以腹部皮下注射等剂量的生理盐水。

1.2.2大鼠纤维化心肌标本的采集和处理 将处理后的模型组和对照组的大鼠处死，开胸取出大鼠心脏，等质量将心脏分为2份，取大鼠心房组织用于实验。其中1份用甲醛溶液脱水后，液体石蜡包埋，将包埋好的心肌组织切片，每片厚5 μm，以留下一步实验。剩余心脏组织置于-80 ℃冷箱待用。

1.2.3HE、Masson染色及胶原容积分数测定 将切片的心肌组织烘烤后用二甲苯脱去切片中的石蜡再经由高浓度到低浓度酒精冲洗。用苏木精染色后蒸馏水冲洗；经过盐酸酒精的分化后返蓝，蒸馏水冲洗后脱水处理，继续HE、Masson染色。图片采用Image Pro Plus 6.0软件进行分析，每张切片取3个无血管的视野，计算心肌组织胶原容积分数CVF(%)=胶原面积/全视野面积×100%。

1.2.4SD乳鼠CFs的提取与培养 将SD乳鼠用乙醇浸泡30 s后，开胸取出心脏，用PBS清洗3次，挤出血凝块。将心脏放至高压灭菌5 ml EP管中，将心脏充分碾碎，加入3 ml Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的混合酶液(Ⅰ型胶原酶 ∶胰蛋白酶比例为1 ∶2)，37 ℃水浴消化，静置后，取上清液移至新EP管中，加入等量培养基混合，将EP管放入低速离心机上(900 r/min离心8 min)，重复上述操作3次。细胞培养1.5 h后再次更换培养基。通过高倍显微镜鉴别CFs，将提取成功的细胞放入细胞培养箱中继续培养，传至3～4代可用于实验。

1.2.5细胞分组 在相同条件下将CFs等细胞数量的种于培养皿中。对照组：正常未经处理的CFs；模型组：CFs使用5 ng/ml转化生长因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)分别刺激24、48 h，使其活化。对照组和模型组均培育相同的时间后处理。

1.2.6CCK-8检测TGF-β1刺激的CFs增殖情况 将CFs分为3组，模型组：TGF-β1刺激CFs增殖24、48 h，对照组：未加TGF-β1刺激在相同条件下培养的CFs。培养完成后用以细胞密度为3×106/L加于96孔板中，每孔100 μl，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，培养2 d后处理。每孔加入10 μl CCK-8试剂，避光孵育2 h后测定光密度(optical density,OD)值，实验重复测量3次。

1.2.7Western blot法检测IGFBP-3、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原前胶原A1( type Ⅰ collagen procollagen A1,COL1A1)的蛋白表达 分别提取心肌组织和细胞的总蛋白，测蛋白浓度后，将蛋白保存于-80 ℃冰箱待用。配制相应胶后，上样后用SDS-PAGE 蛋白电泳体系进行电泳，经过湿转膜后TBST洗膜2×10 min，脱脂牛奶封闭1 h，洗膜4×10 min，摇床上4 ℃孵育IGFBP-3、α-SMA、β-actin、COL1A1 的一抗(根据说明书，IGFBP-3抗体用一抗稀释液以1 ∶800进行稀释，α-SMA、β-actin、COL1A1抗体以1 ∶1 000进行稀释)，过夜后，再次洗膜4×10 min，二抗(用10 ml二抗稀释液加入抗兔/山羊抗鼠的二抗1 μl进行稀释)室温孵育90 min，洗膜4次，每次10 min，最后蛋白采用ECL法显影。蛋白条带采用Quantity One V 4.6软件进行分析，进行吸光度值的检测，计算出蛋白表达水平。

1.2.8qRT-PCR技术检测IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的mRNA表达 提取心肌组织和CFs的总RNA，测定纯度和浓度后，按照TaKaRa试剂盒说明书进行逆转录，逆转录后cDNA放在-80 ℃保存。使用qRT-PCR检测目的基因。反应条件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min预变性；95 ℃、20 s变性，60 ℃、30 s退火，72 ℃、30 s延伸，40个循环的扩增阶段；以95 ℃、15 s，60 ℃、1min，95 ℃、15 s为熔解曲线阶段。以β-actin为内参，以2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。表1为相关引物序列。

表1 IGFBP-3、α-SMA、β-actin 和COL1A1的qPCR的引物序列

2 结果

2.1 HE、Masson染色及胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)测定分析如图1示，HE染色中蓝染的为细胞核，红染的为胞质和胞外基质；Masson染色心肌红染、心肌间质胶原纤维为蓝染。从2种染色中可以观察到，与对照组比较，模型组心肌细胞增生肥大且排列紊乱，胞外纤维组织明显增多。CVF比较：模型组大鼠心肌组织胶原容积分数百分比明显高于阴性对照组(t=49.38，P<0.05)，差异有统计学意义。模型组与对照组的胶原纤维CVF(%)比较见表2。

图1 两组大鼠心肌组织HE和Masson染色的比较 ×400

组别CVF(%) 对照1.72±0.35 模型12.45±1.29∗

与对照组比较：*P<0.05

2.2 注射ISO后对大鼠心肌组织中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白的影响大鼠动物模型中，在大鼠心肌组织中IGFBP-3蛋白表达水平模型组比对照组明显增高(t=37.72，P<0.05)，α-SMA蛋白表达含量模型组比对照组明显增高(t=56.03，P<0.05)，COL1A1的蛋白表达水平模型组高于对照组(t=43.38，P<0.05)，差异有统计学意义。见图2。

2.3 注射ISO后对大鼠心肌组织中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表达的影响以β-actin内参检测mRNA的表达，IGFBP-3的mRNA表达水平模型组明显高于对照组(t=46.21，P<0.05)，α-SMA的mRNA表达水平模型组比对照组显著增高(t=36.37，P<0.05)，COL1A1的mRNA表达水平模型组高于对照组(t=79.58，P<0.05)，差异有统计学意义。见图3。

图2 对照组和模型组IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白表达的变化与对照组比较：*P<0.05

图3 对照组和模型组IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表达的比较与对照组比较：*P<0.05

2.4 CCK-8法检测TGF-β1刺激后CFs的细胞活力CCK-8实验结果见图4，加入TGF-β1刺激24 h(t=43.42，P<0.05)和48 h(t=104.60，P<0.05)后CFs的细胞活力高于对照组，差异有统计学意义。

2.5 加入TGF-β1刺激后对CFs中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1蛋白表达的影响细胞模型中，用TGF-β1刺激24 h CFs所表达的IGFBP-3蛋白表达水平模型组明显高于对照组(t=14.13，P<0.05)，α-SMA蛋白表达含量模型组与对照组比较显著增高(t=26.29，P<0.05)，COL1A1的蛋白表达水平模型组高于对照组(t=13.83，P<0.05)，用TGF-β1刺激48 h的CFs比对照组表达的IGFBP-3(t=62.59，P<0.05)、α-SMA(t=129.30，P<0.05)、COL1A1(t=63.61，P<0.05)的蛋白含量明显增高，且刺激48 h CFs的IGFBP-3(t=28.99，P<0.05)、α-SMA(t=105.25，P<0.05)、COL1A1(t=10.89，P<0.05)的蛋白含量高于刺激24 h，差异有统计学意义。见图5。

图4 对照组和用TGF-β1刺激CFs 24、48 h的细胞活力比较A：未加TGF-β1刺激的CFs(对照组)；B：TGF-β1刺激24 h的CFs；C：TGF-β1刺激48 h的CFs；与对照组比较：*P<0.05

图5 TGF-β1刺激后的CFs模型组与对照组IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的表达比较A：未加TGF-β1刺激的CFs蛋白表达；B：TGF-β1刺激24h的CFs蛋白表达；C：TGF-β1刺激48h的CFs蛋白表达；与对照组比较：*P<0.05

2.6 加入TGF-β1刺激后对CFs中IGFBP-3、α-SMA和COL1A1 mRNA表达的影响以β-actin作为内参，采用相对定量法检测mRNA的表达，TGF-β1刺激24 h后CFs所表达的IGFBP-3(t=45.00，P<0.05)、α-SMA(t=20.15，P<0.05)、COL1A1(t=58.20，P<0.05)的mRNA含量升高，同样，TGF-β1刺激48 h后CFs所表达的IGFBP-3(t=17.77，P<0.05)、α-SMA(t=26.29，P<0.05)、COL1A1(t=37.24，P<0.05)的mRNA含量亦升高，差异有统计学意义。见图6。

图6 对照组与TGF-β1刺激的CFs 24 h和48 h的模型组的IGFBP-3、α-SMA和COL1A1的mRNA含量比较A：未加TGF-β1刺激CFs的mRNA表达(对照组)；B：TGF-β1刺激24 h CFs的mRNA表达；C：TGF-β1刺激48 h CFs的mRNA表达；与对照组比较：*P<0.05

3 讨论

心肌纤维化是心脏在多病理因素下相互作用、共同参与的结果。而心肌成纤维细胞增殖、活化及细胞外基质过度沉积和胶原比例失调，可进一步形成心肌纤维化[7-8]。在心肌纤维化中α-SMA、COL1A1等蛋白过度表达，可作为心肌纤维化的检测指标。

IGFBP调节IGFs与其受体的结合，对细胞内IGFR相关的其他信号的同类传导与表达产生影响。IGFBP-3在体内主要由肝脏的非实质细胞产生，但在其他器官细胞中也有表达，通过自分泌和旁分泌对细胞产生作用[9-10]。相关研究[11-13]表明，在心衰、心肌梗死等一些心血管疾病中促进IGFBP-3的表达可抑制IGF-1的信号转导以阻断IGF-1R/PI3K/Akt通路发挥出抑制细胞活化的作用，IGFBP-3在一些肿瘤的增殖过程中也发挥拮抗增殖的作用，可促进癌细胞的凋亡。从以上可分析在心肌纤维化的病变和CFs活化增殖过程中，IGFBP-3表达升高可能抑制细胞的活化，对心肌纤维化可能产生抑制作用。

通过构建大鼠心肌纤维化及CFs活化的模型，检测模型中IGFBP-3的表达含量并与对照组作对比。动物模型建立后心肌纤维化病理表现明显，细胞实验中，加入TGF-β1刺激后细胞增殖活化明显，检测模型组中α-SMA、COL1A1表达明显升高，结合以往文献[14-15]，说明其建立动物和细胞模型的方法可行。在动物模型和细胞模型中，模型组中IGFBP-3表达含量增高，说明纤维化心肌和活化CFs可影响组织和细胞中IGFBP-3的表达。

综上所述，在心肌纤维化的病理过程中IGFBP-3的表达水平明显升高，表明IGFBP-3可能参与心肌纤维化的病变过程并在其发生机制中起着重要作用，但其具体作用机制尚不明确，有待深入研究。