La-related蛋白1在胆囊癌疾病进展中作用的研究

方德宝，黄大可，江 飞，余宏铸,4

胆囊癌是胆道系统恶性肿瘤中较常见、最具侵袭性的一种[1]。在中国，胆囊癌发病率约占新发肿瘤病例的1.37%,其发病率高达3.82/100 000[2]。因为无特异性的症状、诊断发现迟、缺乏有效的治疗方式和预后指标，胆囊癌的预后不尽如人意。流行病学统计显示胆囊癌的总体生存期约为6个月，5年生存率低于10%[3]。因此，研究胆囊癌的发病机制具有重要的理论和临床意义。La-related蛋白1(La-related pretein 1,LARP1)是一种RNA结合蛋白。LARP1是5′TOP mRNA翻译的关键调控因子[4]，并在细胞内mTOR活性的响应中作为磷酸化感应分子开关调控核糖体mRNA翻译和核糖体生物效应[5]。它通过肿瘤信号通路中mTOR等基因的转录后调控参与了肿瘤的进展[6-7]。但目前LARP1在胆囊癌中的表达情况及其临床价值尚不明确，现通过检测LARP1在非疾病胆囊、胆囊腺瘤和胆囊癌组织中的表达水平；统计分析3组组织标本中LARP1的表达差异以及LARP1表达水平与胆囊癌患者临床病理资料和预后的关系，探讨LARP1在胆囊癌疾病发展中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2011年1月～ 2016年11月经安徽医科大学第一附属医院病理科确诊的胆囊癌组织标本76例，胆囊腺瘤组织标本21例，肝血管瘤联合胆囊切除的非疾病胆囊组织标本27例。采用切片机以4 μm厚度进行连续切片制成组织切片，所得的组织切片均经过病理科医师诊断。电话随访胆囊癌病例至2018年11月，获得完整随访52例，随访1～24个月。76例胆囊癌患者中，男24例，女52例；年龄36～88(63.91±11.94)岁；G1-G2(高-中分化)者51例，G3-G4(差-未分化)者25例；肿瘤TNM分期：0-Ⅰ期20例，Ⅱ-ⅢB期56例。肿瘤的TNM分期和组织分级依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)胆囊癌分期[8]。本研究经医院伦理委员会的批准。

1.2 试剂LARP1多克隆一抗购自英国abcam公司；鼠抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司；柠檬酸抗原修复液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)、内源性过氧化氢酶阻断剂、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)试剂盒、苏木精染色液、中性树胶购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 研究方法免疫组化(streptAvidin-biotincomplex,SABC)法测定每组组织标本LARP1的表达水平，并以细胞胞质中有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性细胞。在Nikon Eclipse 8ic显微镜下，每张切片随机选取5个400倍不连续视野，用Nikon Digital camera摄像并保存待测量图片，Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量所得图片中LARP1染色的平均光密度(optical density, OD)值，取平均OD值作为测量值。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)处理，实验数据以M(P25,P75)表示，多组间采用Kruskal-Wallis H检验分析，两组间差异采用Mann-Whitney U检验分析。分类资料采用卡方检验分析。应用Kaplan-Meier法计算累积生存率，生存率差异比较采用Log-rank检验。应用Cox回归进行单因素及多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LARP1在非疾病胆囊组、胆囊腺瘤组和胆囊癌组中的表达LARP1在非疾病胆囊组、胆囊腺瘤组和胆囊癌组中表达的平均OD值呈进行性增高，3组间比较和各两组间比较的差异均有统计学意义(图1、表1)。非疾病胆囊或胆囊腺瘤与胆囊癌组间的年龄差异有统计学意义(表1)。

2.2 LARP1的表达水平随胆囊癌疾病进展逐渐增高LARP1蛋白在T2-T4期胆囊癌原发灶中的表达水平明显高于Tis-T1期，两组间差异有统计学意义(Z=-2.177,P=0.029)；在进展期胆囊癌亚组(TNM Ⅱ-ⅢB期)中表达水平明显高于早期胆囊癌亚组(TNM 0-Ⅰ期)，两组间差异有统计学意义(Z=-2.361,P=0.018)。另外，LARP1在G3-G4(差-未分化)亚组的表达水平高于G1-G2(高-中分化)亚组，两者差异有统计学差异(Z=-2.849,P=0.004),见表2。

2.3 LARP1与胆囊癌预后的关系Kaplan-Meier analysis 提示的胆囊癌LARP1高表达亚组(OD值≥0.294)的术后生存期低于低表达亚组，差异有统计学意义(Log Rank=7.132,P=0.008)，LARP1高表达亚组的术后中位生存期为5个月，而LARP1低表达亚组的术后中位生存期为18个月(图2)；胆囊癌亚组TNM Ⅱ-ⅢB期的术后生存期明显短于胆囊癌亚组TNM 0-Ⅰ期，差异有统计学意义(Log Rank=18.972,P<0.001)(图3)。Cox proportional hazard regression model单因素分析提示LARP1表达上调、原发灶(T)分期、TNM分期和组织学分级是胆囊癌术后之预后的危险因素，进一步的多因素分析表明LARP1表达上调、TNM分期和组织学分级是影响胆囊癌预后的独立因素(表3)。

与胆囊腺瘤组比较:*P<0.05;与胆囊癌组比较:#P<0.05; 与胆囊癌组比较：**P<0.05;与胆囊癌组比较:##P<0.05;与胆囊癌组比较:△P<0.05

表2 胆囊癌各临床病理亚组中LARP1的表达情况

变量nLARP1表达的平均OD值M(P25,P75)ZP年龄(岁)[4]-0.7220.470 <60490.296(0.209,0.368) ≥60270.291(0.215,0.359)性别-1.2890.197 男240.280(0.209,0.379) 女520.267(0.208,0.335)原发灶(T)[4]-2.1770.029 Tis-T1220.227(0.191,0.336) T2-T4540.309(0.250,0.388)区域转移淋巴结(N)[4]-0.4080.683 N0520.275(0.207,0.384) N1240.303(0.232,0.361)TNM分期[4]-2.3610.018 0-Ⅰ200.226(0.330,0.165) Ⅱ-ⅢB560.309(0.250,0.385)组织学分级[4]-2.8490.004 G1-G2(高-中分化)510.270(0.201,0.335) G3-G4(差-未分化)250.336(0.266,0.427)

表3 单因素及多因素Cox回归模型分析影响术后生存时间的因素

3 讨论

阐述胆囊癌发生的胆囊腺瘤-胆囊癌假说在形态学[9]和DNA测序研究[10]中都得到了验证。近期的研究[11]提示：在年轻韩国胆囊癌患者的肿瘤形成中，胆囊腺瘤-胆囊癌假说较化生-异常增生-胆囊癌假说扮演着更为重要的角色。本实验基于正常胆囊-胆囊腺瘤-胆囊癌假说，利用免疫组化的方法检测了手术病理确诊的非疾病胆囊、胆囊腺瘤和胆囊癌3组石蜡标本组织中LARP1的表达水平，统计分析了3组LARP1表达水平的差异，结果发现LARP1在非疾病胆囊组、胆囊腺瘤组和胆囊癌组中的表达水平呈进行性增高，差异有统计学意义。这提示LARP1可能参与了胆囊癌的发生。本实验中胆囊癌组与非疾病胆囊组或胆囊腺瘤组组间的年龄差异有统计学意义，提示年龄可能是1个胆囊癌发病的危险因素。1份近期的大样本统计也提示胆囊癌的发病率随年龄的增长而增高，其中40.5%的患者年龄≥75岁[12]。

图2 胆囊癌不同LARP1表达水平亚组的术后生存曲线

图3 胆囊癌不同TNM分期亚组的术后生存曲线

T分期[13-14]和组织学分级[15]是胆囊癌的两个重要预后因素，本实验对不同TNM分期和组织学分级亚组的胆囊癌组织中LARP1表达水平进行了检测和统计分析。结果发现：LARP1在胆囊癌亚组TNM Ⅱ-ⅢB期中表达水平明显高于胆囊癌亚组TNM 0-Ⅰ期(Z=-2.361,P=0.018)；同样在G3-G4亚组中的表达水平高于G1-G2亚组(Z=-2.849,P=0.004)。这提示LARP1可能参与了胆囊癌的进展。对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的研究发现：与正常对照细胞相比，NSCLC细胞中LARP1的m-RNA水平增加；敲除LARP1可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭；而且非小细胞肺癌组织中LARP1的过表达与肿瘤进展和不良生存相关。

在直肠癌[16]中，LARP1表达升高与肿瘤的TNM分期和分化程度相关，敲除LARP1可抑制CRC细胞的增殖；多因素分析提示LARP1是影响直肠癌总生存率的独立预后因素。为了解LARP1表达水平与胆囊癌患者术后生存时间之间的关系，课题组根据LARP1表达水平的不同将患者分为高表达亚组和低表达亚组，并以此制作了Kaplan-Meier生存曲线。结果表明LARP1表达越高的患者术后生存时间越短，而且2组间差异有统计学意义(Log Rank=7.132,P=0.008)。进一步的单因素和多变量COX回归统计分析显示LARP1、TNM分期和组织学分级是影响胆囊癌术后之生存时间的独立危险因素。

综上所述，LARP1作为一种潜在的生物标志物，为胆囊癌的诊断和预后分析提供了新的手段，为胆囊癌的治疗提供了新的见解和研究思路，但如何有效调控LARP1细胞内表达的具体机制，尚需要进一步的探索。