microRNA-100对乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖能力的负调控作用

徐绍莲，何晓刚，张 露，汪 刚，罗 涛，徐晓丹，徐晓军，3，李菲菲

研究乳腺癌的发生机制至关重要。目前，越来越多的研究显示，miRNA的异常表达与乳腺癌的发生发展密切相关[1]。微小RNA(microRNA, miR)是一类由19～25个核苷酸组成的非编码小RNA，广泛存在于植物、动物和病毒中。 miRNA通过调控多种基因表达，参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程，在肿瘤发生、发展中具有重要的作用。其中miR-100异常表达对肿瘤发生、发展的作用受到了人们的广泛的关注[2]。miR-100位于11号染色体上，长度为22个核苷酸组成[3]。有研究[4-5]表明miR-100可以通过靶向不同分子如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、保罗样激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)、swi/snf相关基质相关的肌动蛋白依赖性染色质亚群调节因子5(SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5，SMARCA5)等来调节肿瘤细胞凋亡、自噬、增殖和迁移，干细胞自我更新和药物敏感性。但它是否对正常细胞存在恶性转化效果尚不清楚。课题组前期的研究显示miR-100在正常乳腺组织中较高，而在乳腺癌患者的癌组织标本中明显表达下调，miR-100的缺失可能与乳腺细胞向乳腺癌细胞的恶性转化有关。故现通过分析比较组织和细胞水平miR-100的表达差异，探讨miR-100表达水平改变对正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞增殖能力的直接影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂miR-100拟态片段慢病毒表达载体(lentiviral vector 3 of miR-100 mimics，LV3-miR-100 mimics)，miR-100拮抗片段慢病毒表达载体(lentiviral vector of miR-100 inhibitor，LV3-miR-100 inhibitor)以及相应的模拟片段和拮抗片段的病毒阴性对照组(negative control，NC)均为100 μl/tube，滴度为109TU/ml，由上海吉玛制药技术有限公司制造。永生化的正常乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌细胞MCF-7、MB-231细胞(三阴性人乳腺癌MB-231腺癌细胞系)(安徽医科大学病理学与病理生理学教研室常规培养的细胞种类)。嘌呤霉素(Puromycin)购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 实验分组MCF-10A细胞分为MCF-10A对照组(Control，正常对照组)、转染阴性慢病毒载体组(Negative control，NC对照组)、下调miR-100表达即miR-100 inhibitor 转染组(inhibitor)。MCF-7细胞分为MCF-7对照组(Control，正常对照组)、转染阴性慢病毒载体组(Negative control，NC对照组)、上调miR-100表达即miR-100 mimics 转染组(mimics)。

1.3 miRNA慢病毒感染建立稳定细胞系感染前1 d将状态良好的且处于快速生长期的细胞进行常规处理，离心重悬后进行细胞计数、铺板。细胞数以次日转染慢病毒载体时，24孔板孔中细胞密度达到40%，按4×104/孔铺板。转染效率最好的为MCF-10A细胞，其MOI值为10(病毒滴度为1E+7TU/ml)。转染病毒前，用PBS清洗吸取的培养基1次，病毒提前从 -80 ℃冰箱中取出并融化，使用前进行离心处理。将10 μl LV- miR-100 mimics或 LV- miR-100 inhibitor、150 μl 二醇甲醚(proprylene glycol monomethyl ether，PM)、340 μl DMEM-F12完全培养基混匀后加入24孔板中，并设1个复孔。感染NC慢病毒组操作相同。感染8 h后，将培养基全部吸取并加入DMEM-F12完全培养基。加入慢病毒60 h后，荧光倒置显微镜下观察细胞状态和荧光表达情况，再用嘌呤霉素筛选稳定的细胞株。

1.4 q-PCR检测MB-231、MCF-7和MCF-10A细胞中miR-100的表达RNA提取按照安徽医科大学病理学与病理生理学实验室常规操作进行，逆转录合成cDNA作为下一步q-PCR反应模板，将反应管放入ABI7500荧光定量PCR仪中，先95 ℃ 、3 min后，进行以下反应程序：95 ℃、12 s， 62 ℃、40 s，总共40个循环；选用染料SYBR检测荧光基团，62 ℃进行检测。以U6为内参，Ct为循环数，ΔCt为miR-100的循环数与U6循环数之差，ΔΔCt=miR-100ΔCt一校正样品△Ct，用2-ΔΔCt法计算miR-100的相对表达量。

1.5 MTT检测细胞活力将状态良好的且处于快速生长期的MCF-10A、MCF-7细胞常规细胞处理，离心重悬后取20 μl细胞悬液计数。调整细胞数为10 000/ml，在96孔板中以3 000个/孔细胞铺板，各组细胞设5个复孔，每孔培养液体积为200 μl。待细胞贴壁伸展后，在避光的环境下，将Formazan溶解液和MTT试剂以4 ∶1的比例混匀后，向实验孔和调零孔加入50 μl/孔。培养箱孵育4 h后收板，利用酶标仪在490 nm检测各孔细胞的吸光度。

1.6 平板克隆实验检测细胞克隆形成能力选状态良好的且处于快速生长期的MCF-10A、MCF-7细胞进行常规细胞处理，离心重悬成单个细胞悬液后，取20 μl细胞悬液计数。调整细胞数为10 000/ml。在6孔板中以500个/孔细胞铺板，各组细胞设2个复孔，每孔培养液体积为2 ml。吸取相应细胞数的细胞悬液加于6孔板中。 培养10～14 d终止培养。多聚甲醛结晶紫溶液染色1 h、室温晾干、拍照、计数，计算克隆形成的比例(克隆数目/500×100%)。

2 结果

2.1 miR-100在组织学和细胞学水平的表达谱从安徽医科大学第一附属医院乳腺外科收取38例临床新鲜的乳腺癌组织和癌旁组织标本。通过原位杂交检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR-100的表达，结果显示癌旁组织中miR-100的表达明显高于癌组织，如图1，棕染颗粒所示为阳性表达。

通过q-PCR实验，检测miR-100在乳腺癌细胞MB-231、MCF-7和正常乳腺上皮细胞MCF-10A的表达情况，结果发现miR-100在乳腺癌和正常乳腺上皮细胞中的表达存在显著差异，miR-100在乳腺上皮细胞中的表达量最高，而在乳腺癌细胞系MCF-7和MB-231中明显降低，并且在恶性程度较高的MB-231中最低。两两比较结果显示，两株癌细胞与正常细胞比较差异均有统计学意义(t=3.10、3.19，P<0.05)，MCF-7与MB-231比较，差异无统计学意义(t=0.09，P=0.945)。见图2。

图1 原位杂交检测miR-100在乳腺癌组织和癌旁组织中表达差异

2.2 建立稳定高表达miR-100乳腺癌细胞株和低表达miR-100乳腺上皮细胞株由于miR-100在MCF-10A细胞中的表达高于MCF-7细胞。因此，在MCF-10A细胞中转染miR-100 inhibitor的慢病毒载体(图3A)，在MCF-7细胞中转染miR-100 mimics的慢病毒载体(图3B)。结果表明：转染了miR-100 inhibitor的MCF-10A细胞中，miR-100的表达水平明显低于对照组(图3C)；而转染miR-100 mimics的MCF-7细胞中，miR-100的表达水平明显高于对照组(图3D)。上述结果显示，通过慢病毒转染的方式构建了稳定下调miR-100表达的MCF-10A细胞株和稳定上调miR-100表达的MCF-7细胞株。

图2 miR-100在正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达差异与正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较：*P<0.05

2.3 miR-100可以抑制细胞活力MTT实验结果表明：下调MCF-10A细胞中miR-100的表达促进细胞的活力(图4A)；而在MCF-7细胞中过表达miR-100后，细胞的活力与对照组比较明显降低(图4B)。上述实验结果显示，下调miR-100的表达促进乳腺上皮细胞活力，上调miR-100的表达可能抑制乳腺癌细胞的活力。

2.4 miR-100负调控克隆形成能力细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。接种细胞于6孔板中，15 d后收板。结果显示，与对照组相比，下调miR-100的表达，促进MCF-10A克隆数目和体积，促进其克隆形成能力。促进miR-100的表达，抑制了MCF-7细胞的克隆大小和数目，见图5A、B。

3 讨论

肿瘤细胞的恶性转化通过多步骤过程发生，该过程涉及多重功能性和表观遗传学调控，这也被认为是干预治疗面临最具挑战性的问题之一[6]。最近多个关于microRNA参与肿瘤发生的研究已经表明这些非编码小RNA在细胞恶性转化中起重要作用[7-10]。乳腺癌的发生机制复杂，其中正常乳腺上皮细胞如何发生恶性转化导致乳腺癌发生发展的机制仍不很清楚。近年来研究发现miRNA参与癌基因上调、抑癌基因下调或失活、细胞增殖、侵袭能力增强、干性增强等起到重要作用[11-14]。如前所述，miR-100在多个肿瘤的发生发展中具有重要作用，但在乳腺癌的发生发展尤其是对正常乳腺细胞的恶性转化作用机制尚不明。

图5 miR-100对MCF-10A、MCF-7细胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影响A：miR-100对MCF-10A细胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影响； B：miR-100对MCF-7细胞平板克隆形成能力和集落形成能力的影响; 与control和NC两个对照组比较：*P<0.05

本实验研究中首先建立稳定下调miR-100表达的乳腺上皮细胞株和上调miR-100的乳腺癌细胞株。通过体外实验检测miR-100的不同表达水平对MCF-10A和MCF-7细胞生物学功能的影响；结果显示，下调miR-100的表达促进MCF-10A细胞的活力以及克隆形成能力；上调miR-100的表达抑制 MCF-7细胞的活力以及克隆形成能力。

结果表明：一方面miR-100作为一种抑癌分子，其缺失或功能抑制可能是乳腺上皮细胞发生恶性转化，促进乳腺癌发生的潜在重要分子机制；另一方面，在乳腺癌细胞中增加其表达有抑制肿瘤恶性行为的作用，提示其可以成为治疗乳腺癌的潜在有效靶点。但是，miR-100在乳腺细胞中究竟通过靶向何种基因导致了以上改变，本研究尚未涉及， 由于乳腺癌细胞来源可能与普通细胞发生EMT转化成具有“干性”的细胞有关[15-16]，本课题组在实验过程中也观察到下调miR-100的表达，细胞的形态呈现梭形，显示间质样形态。提示下调miR-100可以促进EMT的发生而发挥恶性转化作用。课题组将在后续研究中进一步探讨。本研究为今后以miR-100为核心，发现有效治疗乳腺癌、干预高危人群发生乳腺癌及阻止乳腺癌发生侵袭转移提供了重要的思路和研究方向。