分选蛋白SNX4在小鼠睾丸中的表达和定位研究

李 堃，刘 悦，黄 鹏，杨智昉，胡 茜，张 颖，李志宏，吕叶辉，梁 乐

分选连接蛋白 (sorting nexins, SNX)家族是进化保守的磷酸化蛋白结合蛋白，其在协调膜质货物分类过程中起着重要作用[1]。可将SNX分为SNX-BAR、SNX-FERM、PX only 等亚科[2]。这些蛋白质在内吞小泡的降解途径中起着分选和回收货物的重要作用。

SNX4是SNX-BAR亚科的一个成员。SNX-BAR蛋白可以通过BAR结构域[3]的相互作用在膜表面寡聚，从而包裹膜小管。SNX4可与双载蛋白2(amphiphysin 2)协同作用[4]，为转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)[5]和钙黏蛋白[6]脱离溶酶体并进入循环途径的关键分子。SNX4是唯一在体外形成稳定的同二聚体或者与SNX7或SNX30形成异二聚体的SNX家族成员[3]。SNX4通过与微管运动动力蛋白的辅激活剂KIBRA结合，诱导内吞再循环小泡(endocytic recycling compartment，ETC)转运到细胞的核周区域。该研究旨在探索SNX4在睾丸中的表达和定位，进而推测其功能。

1 材料与方法

1.1 材料选择出生后8周雄性C57BL/6小鼠，体质量约25 g，根据实验分组，每组5只，由中科院上海实验动物中心提供。TRIzol RNA抽提试剂(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒、DNA分子量标准、Premix ex-Taq(大连宝生物公司)；抗SNX4抗体、抗Rab5抗体、正常兔IgG、FITC标记羊抗兔IgG、TRITC标记羊抗大鼠IgG(美国Abcam公司)。Laminin包被培养皿(美国BD公司)、DMEM培养液中添加5%FBS、青链霉素双抗(美国Gibco公司)。新鲜配制使用。DPBS、乙醚、BSA等一般化学试剂购自上海化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠睾丸SNX家族基因表达分析 抽提小鼠睾丸总RNA后，反转录成cDNA。按照Premix exTaq说明书，以表1所示引物在ABI7500荧光定量PCR仪上进行定量扩增。记录CT值，用2-ΔΔCT法计算mRNA表达变化。

1.2.2小鼠各脏器SNX4基因表达分析 抽提小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑、睾丸总RNA后，反转录成cDNA。按照Premix exTaq说明书，以表1所示引物在ABI7500荧光定量PCR仪上进行定量扩增。记录CT值，用2-ΔΔCT法计算mRNA表达变化。

1.2.3睾丸SNX4免疫组化染色 迅速取出小鼠睾丸，去除多余组织，4%多聚甲醛固定，石蜡切片，入PBS洗3次，每次15 min。用新配置的0.3% H2O2处理，室温30 min。PBS洗3次，每次5 min。用10%山羊血清室温封闭1 h。滴加兔抗小鼠SNX4抗体，1 ∶100稀释，4 ℃过夜。PBS洗3次，每次5 min。阴性对照采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同条件下孵育(实验组n=5，阴性对照组n=5)。滴加羊抗兔第二抗体，1 ∶300稀释，室温孵育15～ 60 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加ABC复合物，室温15～60 min。PBS 洗3次，每次5 min。用0.01% H2O2的DAB溶液，室温5～30 min。用苏木精复染细胞核。镜检、拍照。

表1 Real-time PCR引物

1.2.4TM4细胞培养 37 ℃水浴快速解冻复苏TM4细胞，加入DMEM高糖培养基+10% FBS+1%青链霉素中，37 ℃、5% CO2培养。2～3 d换液1次，待其生长恢复稳定后，每2 d按1 ∶3传代1次。传代1～3次后取生长良好的细胞用于实验。

1.2.5TM4细胞SNX4与Rab5间接免疫荧光染色 取TM4细胞，PBS洗3次，每次3 min，用10%山羊血清室温封闭1 h，加入兔抗小鼠SNX4单克隆抗体和大鼠抗小鼠Rab5单克隆抗体，1 ∶100稀释，4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次3 min，再加入FITC标记羊抗兔IgG，TRITC标记羊抗大鼠IgG，1 ∶300稀释，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，甘油PBS封片。阴性对照组采用免疫前兔血清或正常兔血清替代一抗，在相同条件下孵育。激光共聚焦显微镜(LSM-510 laser scanning confocal microscope, Carl Zeiss)观察并扫描成像。

2 结果

2.1 小鼠睾丸SNX家族基因表达分析如图1所示，在小鼠睾丸中，SNX1和SNX4两个SNX家族成员的mRNA相对表达量高于其它的家族成员，分别可以达到SNX33mRNA相对表达量的(20.94±0.05)倍(P=0.002 9，n=5)和(10.11±0.01)倍(P<0.003 4，n=5)。SNX3、SNX13、SNX14的mRNA的相对表达量可以达到SNX33的约5倍左右(P=0.033，n=5；P=0.036，n=5；P=0.038，n=5)。

图1 小鼠睾丸SNX家族基因表达分析

2.2 小鼠各脏器SNX4基因表达分析如图2所示，在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、脑和睾丸中，其中睾丸的SNX4的mRNA的相对表达量高于其他的脏器。可以达到肝脏中mRNA相对表达量的(15.49±4.92)倍(P=0.0036,n=5)。其他几个主要脏器之间SNX4 mRNA相对表达量无明显差异。

图2 小鼠各脏器SNX4基因表达分析

2.3 小鼠睾丸中SNX4表达定位免疫组织化学染色显示，在小鼠睾丸中，SNX4染色主要集中在支持细胞(sustentacular cell, 又称Sertoli细胞)中，在各级生精细胞中和间质细胞(Leydig 细胞)中均未见明显染色。见图3A。

2.4 TM4细胞中SNX4和Rab5表达定位免疫荧光染色显示，在TM4细胞中SNX4(绿色)和Rab5(红色)定位于细胞质中，染色呈现圆球点状。并且在细胞中部近核周区域，SNX4和Rab5呈现共定位的状态(黄色)。见图3B。

3 讨论

内体系统的主要功能是获取营养、控制蛋白质和脂质代谢、保护机体免受病原体侵袭，并作为细胞膜的储藏库，支持Sertoli细胞膜表面积的快速变化。内吞作用将膜受体和细胞外配体进行内吞。然后，他们进入内体系统进行分选和处理。其主要途径有：① 分子经早期内体发育成晚期内体，最终到溶酶体进行降解。② 分子由囊泡和管状运输载体介导，运送到目的地。其中“循环”途径(recycling)将分子从内体传输到质膜，而“逆行”途径(retrograde)将分子从内体传输到高尔基体，从而远离降解途径[7]。

SNX家族成员在内体分选转运过程中发挥重要作用。所有的SNX家族成员都含有一个PX区域(PX domain)，PX结构域对含有磷脂酰肌醇的内体膜具有特异性。有研究[8]表明SNX家族成员SNX16与乳腺癌细胞的迁移和侵袭有关。

图3 SNX4在睾丸和TM4细胞中的定位 ×40A:SNX4在睾丸中免疫组织化学；B:SNX4和Rab5在TM4细胞中的免疫荧光染色，上排3个图为单个TM4细胞免疫荧光染色，图中比例尺为20 μm；下排3个图为共定位区域的局部放大图像，图中比例尺为10 μm

在SNX的众多家族成员中，睾丸中SNX1和SNX4的表达高于其他的家族成员。SNX1往往和SNX5或者SNX6形成二聚体而作为retromer的重要组成部分[9]，在磷酸甘露糖受体，分拣相关受体L(SORLA)，Wnt 信号因子(Wls)和二价金属转运受体(DMT1)等受体从内体到高尔基体的转运[10-11]起重要作用。实验结果显示，睾丸中SNX5的表达量相对较低，推测睾丸中SNX1和SNX6形成二聚体而参与物质的“逆行”途径。

该实验结果表明，睾丸中SNX4的表达高于肝脏、脾脏、肾脏和脑。这提示在睾丸中表达的SNX4可能参与了睾丸中特有的物质转运，并且睾丸中SNX4定位于Sertoli细胞的胞质中。

Sertoli细胞不仅为生精细胞提供营养和支持作用，并且为精原细胞迁移、增殖、分化、精子发生、精子变形及结构成熟等活动提供必要的微环境。研究[12-13]表明，细胞内吞作用(endocytosis)是调节Sertoli细胞连接的重要途径。在雄激素和细胞因子(如TNF-α、TGF-β2、TGF-β3)的作用下，Sertoli细胞通过细胞内吞作用清除细胞连接处的连接蛋白，从而“打开”细胞连接结构。这些含有连接蛋白的内吞小泡可以与早期内体融合形成内体[14]。然后，根据不同信号的调控，雄激素可以促进内体再循环[15]，将连接蛋白运输至细胞膜，形成新的细胞连接；而TGF-β、TNF-α信号则促进内体与溶酶体融合[12-13]，降解连接蛋白，从而有利于清除细胞连接结构。在生精周期中，Sertoli细胞通过调节细胞内吞及后续囊泡运输的方向，既保证了细胞连接周期性的“开放”，又维持了正常的血睾屏障功能。

免疫荧光染色显示，SNX4和Rab5在Sertoli细胞系中共定位于中部近核周区域。提示SNX4可能定位于早期内体，并且可能参与了早期内体的成熟和早期内体中部分分子的再循环利用。

综上所述，在小鼠睾丸中，SNX4高表达，定位于Sertoli细胞并且与早期内体的标志物Rab5具有共定位的特性。