分散液液微萃取技术及其在生物样品分析中的研究进展

施艺玮, 张 宁, 操 雯, 洪战英

(第二军医大学药学院药物分析学教研室, 上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室, 上海 200433)

分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)是一种新型样品前处理技术,Rezaee等[1]于2006年首次提出分散液液微萃取的概念并将其应用于测定水中有机组分的含量,DLLME技术仅使用极少量有机溶剂即可完成萃取、富集过程。DLLME技术由于其低成本、低污染、高富集等优点,近年来受到广泛关注,新型萃取剂不断涌现,各种辅助分散模式使萃取效率明显提高,由此衍生出DLLME的多种模式,并已应用于生物、药物分析[2]、环境污染[3,4]、食品安全[5]等多个领域。本文拟对DLLME技术的多种模式及其近5年在生物样品分析领域的应用进行综述。

1 DLLME的不同模式

根据萃取剂的性质,DLLME可分为常规分散液液微萃取(normal DLLME,n-DLLME)、离子液体分散液液微萃取(ionic liquid DLLME, IL-DLLME)、低密度溶剂分散液液微萃取(low-density solvent DLLME, LDS-DLLME)和悬浮固化分散液液微萃取(DLLME based on solidification of floating organic droplet, DLLME-SFOD)。根据辅助分散方法,DLLME还可分为超声辅助分散液液微萃取(ultrasound-assisted DLLME, UA-DLLME)、空气辅助分散液液微萃取(air-assisted DLLME, AA-DLLME)，以及涡旋辅助分散液液微萃取(vortex-assisted DLLME, VA-DLLME)等。DLLME的分类见图1。

图1 分散液液微萃取的分类及其在生物样品中的应用Fig. 1 Classification of DLLME and application to biological samples n-DLLME: normal dispersive liquid-liquid microextraction; IL-DLLME: ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction; DLLME-SFOD: dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet; LDS-DLLME: low density solvent dispersive liquid-liquid microextraction; UA-DLLME: ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction; VA-DLLME: vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction; AA-DLLME: air-assisted dispersive liquid-liquid microextraction.

1.1 常规分散液液微萃取

n-DLLME是将与水不相混溶的萃取剂及能与水、萃取剂互溶的分散剂混合后注入样品溶液中,萃取剂在分散剂的作用下快速分散在样品中对目标物质进行萃取,离心得萃取相,用微量注射器转移后进行处理或直接分析[6],具体流程见图2a。n-DLLME常用的萃取剂有氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烷等,分散剂有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇等,其中萃取剂和分散剂的种类与体积对目标化合物的萃取和富集均有较大影响。Alcantara等[7]建立了n-DLLME与气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测人血浆中左乙拉西坦,分别考察了氯仿、二氯甲烷、四氯甲烷作为萃取剂时对左乙拉西坦富集因子的影响,最终选择富集结果较好的氯仿作为萃取剂,并考察了使用不同体积(50、90、130、170 μL)的氯仿对萃取效果的影响,选择最佳体积为130 μL,左乙拉西坦的LOD为2 μg/mL。Chen等[8]测定人尿液和血清中免疫抑制类药物环孢菌素、依维莫司等,考察了甲醇、乙腈、丙酮作为分散剂的效果,最终选择富集结果较好的丙酮作为分散剂,并考察了不同体积(200～260 μL)丙酮对萃取效果的影响,最终选择200 μL丙酮,环孢菌素、依维莫司等富集因子在101～122之间,血清中的LOD为6～29 nmol/L,尿液中的LOD为9～60 nmol/L。研究发现随着分散剂体积增加萃取效率逐渐提高,但超过最佳体积后萃取效率明显降低,主要原因为分散剂体积增大导致萃取剂在样品中的溶解度增加,降低萃取效率。

此外,溶液pH值、盐浓度对n-DLLME的萃取效率也有较大影响,调节溶液pH值可以使目标化合物形成非离子型而提高萃取效率,但是pH值过高可能导致部分待测物的降解;盐的加入可通过盐析作用提高富集效率,而盐浓度过高会产生盐溶作用导致富集效率下降。Gupta等[9]测定人尿液中多环芳烃类化合物(PAH)代谢物,采用HCl和NaOH调节pH值,考察了不同pH值(2、4、6、8、10、12)下PAH的萃取效率,结果显示pH为6时萃取效率最高,并考察了盐的含量(0%～10%, w/v)对PAH富集因子的影响,结果显示富集程度在盐的含量为6%时最高,盐的含量偏高或偏低时富集效果都有所降低。由于萃取过程极短,其余影响因素(例如萃取时间和萃取温度等)对实验并没有较大的影响。

n-DLLME的萃取效率相对于其他萃取技术而言有所提高,但其本身存在一定的局限性,主要是萃取剂挥发性高且毒性较大、人工振荡效率较低、重现性较低等。

图2 (a)n-DLLME、(b)DLLME-SFOD和(c)AA-DLLME萃取过程示意图Fig. 2 Diagrams of the extraction processes of (a) n-DLLME, (b) DLLME-SFOD and (c) AA-DLLME

1.2 新型萃取剂DLLME

1.2.1离子液体分散液液微萃取

离子液体(ILs)是由阴离子和阳离子组成,在常温下呈液态,通过改变有机配体可调控ILs的极性,从而选择性萃取不同极性的化合物,ILs对无机物和有机物均有较好的溶解能力且稳定性好。n-DLLME中所用到的萃取剂大多为有毒有害的有机物,不利于实验操作人员的健康和环境,离子液体挥发性较低且毒性较小,近年来在微萃取领域的应用日益增多,是理想的绿色溶剂。离子液体既可以作为萃取剂,也可以作为分散剂,可减少有机溶剂的使用。常用的离子液体萃取剂有1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C4MIM][PF6])、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C6MIM][PF6])和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8MIM][PF6])[10]等。

Gong等[10]采用IL-DLLME结合高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定小鼠血清中达那唑,对萃取剂离子液体的种类和体积、pH、盐浓度以及萃取时间进行优化,考察了[C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]、[C8MIM][PF6] 3种离子液体分别作为萃取剂的萃取效果,结果发现三者中疏水性最强的[C8MIM][PF6]萃取结果最好,因此选择[C8MIM][PF6]作为萃取剂;在血清样品中加入30 μL[C8MIM][PF6], 100 μL 2 mol/L NH3-NH4Cl缓冲溶液(pH=8), 50 μL 1 mol/L NaCl溶液,将混合溶液在两个头部相连的注射器中来回注射7次,样品经离心处理后,取底部萃取相进样分析,该方法得到了较好的萃取效果,达那唑的LOD为0.054 μg/mL,提取回收率为90.5%～103.4%。Arain等[11]测定了人血清中铜的含量,首先加入500 μL 5×10-2mol/L金属离子螯合剂羟基喹啉与铜离子发生螯合作用,调节pH至7.0,加入1 000 μL萃取剂(100 μL [C4MIM][PF6]与200 μL TX-100混合后5 mL水稀释),离心后分离萃取相加入50 μL 1%Triton X-114, 55 ℃恒温水浴2～5 min,离心得到底部黏稠的萃取相,除去上层液体,用0.5 mL酸性乙醇(含0.1 mol/L HNO3)稀释萃取相后采用火焰原子吸收光谱仪(flame atomic absorption spectrophotometer, FAAS)分析,结果显示铜离子的LOD为0.132 μg/L,富集因子为70。

IL-DLLME的优点在于此法中萃取剂离子液体为绿色溶剂,减少环境污染。但也存在不足,如合成离子液体的成本高、离子液体的低挥发性导致其不适用于气相色谱等[12]。

1.2.2低密度溶剂分散液液微萃取

n-DLLME和IL-DLLME中所用萃取剂密度均大于水,离心后萃取相在溶液底部,且萃取相体积较小导致相分离困难,LDS-DLLME采用密度低于水且低毒的萃取剂辛醇、甲苯等,离心后萃取相漂浮于样品上层易分离,操作方法如下:将萃取剂及分散剂的混合溶液注入样品溶液中,将样品离心处理后,由于萃取剂密度小于水,萃取相漂浮于液体上层,进样器定量吸出后直接或经处理后进行分析。

Mollahosseini等[13]采用毒性小且符合色谱条件的1-辛醇作为萃取剂并结合RP-HPLC测定人血清中25-羟基胆钙化醇,分散剂选择650 μL甲醇,萃取时间为1 min, 25-羟基胆钙化醇的富集因子为180,提取回收率为85%～97%,该方法中萃取相分离简便,杂质干扰低。Barfi等[14]采用LDS-DLLME法萃取人尿液中水杨酸,双氯芬酸和布洛芬,分别考察了正辛醇、正己醇、甲苯、正庚烷、正己烷5种低密度萃取剂的萃取效果,正己烷和正辛醇的提取效率远大于其余3种萃取剂,最终选择具有较好色谱行为的正辛醇作为萃取剂,萃取剂体积为55 μL,分散剂选择350 μL丙酮,水杨酸、双氯芬酸和布洛芬的提取回收率为56%～65%,富集因子为51～59,萃取效果较好。

LDS-DLLME的优点在于此法中萃取剂的毒性较低且大多数适用于色谱分析,萃取相处于样品上层易于分离,可避免常规模式中由于萃取有机相体积过小,导致采集萃取相过程中会混入少量水样而可能缩短气相色谱仪器使用寿命[15]的情况发生。

1.2.3悬浮固化分散液液微萃取

n-DLLME中所用到的萃取剂大多为沸点较低的有机物,有机物挥发对环境和实验操作人员的健康具有不利影响,DLLME-SFOD采用熔点略低于室温(10～25 ℃)的萃取剂,如正十一醇、十二醇等,密度低于水且毒性较小。操作方法如下:将萃取剂及分散剂混合后注入样品溶液中,将样品离心后低温处理,样品上层漂浮着凝固的萃取相,取出后经处理进行分析,具体流程见图2b。

Shirinnejad等[16]采用DLLME-SFOD对血浆样品中的萘普生进行提取和预富集,在最佳条件下(120 μL十一烷醇与1 mL乙醇分别作为萃取剂和分散剂,pH=3.5, 2 mL 10%(w/v)KCl盐溶液),在10.0～120.0 ng/mL范围内呈线性,萘普生的LOD为2.4 ng/mL。Iqbal等[17]采用n-DLLME联合超声辅助反萃取技术结合超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)法测定人尿中苏沃雷生(suvorexant), 20 μL 1-十一烷醇和200 μL乙腈分别作为萃取剂和分散剂,经过离心相分离、低温相凝固过程,得到漂浮的凝固液滴,在超声辅助反萃取下得到待测物,结果显示,该方法在0.27～1 000 ng/mL范围内具有良好的线性,苏沃雷生检出限和定量限分别为0.10 ng/mL和0.27 ng/mL。DLLME-SFOD过程中温度控制对待测物的萃取效果具有较大的影响,升高温度可以增加待测物与萃取剂接触面积,提高萃取效率。Wu等[18]建立一种DLLME-SFOD快速高效萃取6种邻苯二甲酸酯的方法。通过对影响萃取效率因素的优化,选择十二烷醇作为萃取剂,并考察萃取温度对十二烷醇萃取效率的影响,结果显示,萃取效率在温度从30 ℃升高至60 ℃的过程中逐渐增长,当萃取温度超过60 ℃,萃取效率不再明显增加,因此选择60 ℃作为最佳萃取温度。

DLLME-SFOD最大的优点在于此法中萃取相的分离十分简便,但由于对萃取剂的物理性质要求,萃取溶剂的选择范围较小,限制了该法的应用[15];萃取过程中可以通过引入AA-DLLME, VA-DLLME和UA-DLLME等技术来减少分散剂的用量,并缩短分析时间和离心时间,但对富集因子和回收率影响不大[19]。

1.3 辅助分散DLLME

1.3.1超声辅助分散液液微萃取

UA-DLLME模式中,超声辅助使萃取剂与分散剂快速地分散在样品中,形成乳状小液滴,可代替n-DLLME中的人工振荡,分散程度更高。Fernández等[20]用UA-DLLME法萃取人血浆中米氮平、文拉法辛、艾司西酞普兰、氟伏沙明、氟西汀和舍曲林6种抗抑郁药,采用200 μL氯仿作为萃取剂,2.5 mL乙腈作为分散剂,超声3 min, pH调至9.8,萃取结果较好,提取回收率为95%～110%, LOD为4～5 ng/mL;与常用方法液相萃取(liquid-liquid extraction, LLE)相比,UA-DLLME所耗有机溶剂更少,准确度、精密度以及LOD均较好。Malaei等[21]建立了UA-DLLME法联合气相色谱-火焰离子化检测器法测定人血清中丙二醛,选择80 μL 1,2-二溴乙烷作为萃取剂,5 mL乙腈作为分散剂,考察了超声0～7 min对萃取效果的影响,在无超声辅助下,萃取效率较低,超声时间延长至3 min,萃取效率明显增加,3 min后无明显改变,在超声时间4 min、pH为4的条件下萃取效果最佳,丙二醛的富集因子为79.8,提取回收率为95.8%, LOD为0.75 ng/mL,该法相比前期实验所用LLE、固相萃取(solid-phase extraction, SPE)两种方法,萃取效果好,富集因子明显提高且使用有机溶剂量明显减少。

UA-DLLME的优点在于该方法采用超声辅助萃取,提高了振荡效率,加快萃取剂在样品中分散,相对n-DLLME而言,萃取效率明显提高。但也有文献报道,超声辅助乳化时间过久会导致待测物的分解,缩短乳化时间或者人工振摇可以避免分解[22]。UA-LDS-DLLME可减少分散剂的使用量,其通过超声辅助的方法使萃取剂分散在样品中,可以大大提高实验的环境友好性[23]。

1.3.2涡旋辅助分散液液微萃取

VA-DLLME是利用涡旋原理对样品及萃取剂进行混合,在涡旋条件下,萃取剂可以更加快速地分散在样品中,涡旋有助于萃取剂形成小液滴,可以减少分散剂的用量[24]。VA-DLLME具有萃取时间短、环境污染小、成本较低等优点,但该法的萃取效率相较于n-DLLME并没有明显改善。

Zhang等[24]使用疏水性共晶溶剂作为萃取剂,VA-DLLME联合HPLC富集,间接测定尿液和唾液中痕量亚硝酸盐,该方法基于亚硝酸盐与对硝基苯胺和二苯胺在酸性水中的重氮化偶联反应,通过测定偶氮化合物间接定量亚硝酸盐。萃取剂为150 mg三辛基甲基氯化铵-油酸(摩尔比为1∶2)油状液体,混合溶液涡旋100 s,通过离心得到萃取相,结果显示,该方法的线性范围为1～300 μg/L, LOD为0.2 μg/L, LOQ为1 μg/L,在生物样品中的提取回收率为90.5%～115.2%。Akramipour等[25]采用1-十一烷醇和离子液体1-辛基-3-甲基咪唑氯化物的混合溶剂萃取人尿液中各种存在形式的汞,将混合溶剂与样品混合置于50 ℃的水浴中,加入350 mg NaCl破乳,涡旋3 min后离心,冰浴后得到样品上层凝固的萃取相,其中涡旋步骤可以辅助萃取相与样品充分接触,提高破乳过程中目标物质的萃取效率,实验考察了不同涡旋时间(0～5 min)的萃取效果,发现0～3 min内,汞的萃取效果随着时间的延长逐渐变好,3 min后没有明显提高,最终选择涡旋3 min,此时汞的富集因子为112, LOD为0.1 μg/L。

1.3.3空气辅助分散液液微萃取

AA-DLLME是将样品与萃取剂混合后通过注射器多次吸入、排出,形成均匀分散的状态,萃取后通过离心相分离,具体流程见图2c。该法不需要分散剂,通过注射器多次吸入排出可达到分散的效果。Rocha等[26]采用AA-DLLME联合LC-MS/MS同时测定人尿液中7种双酚类化合物、7种对羟基苯甲酸酯类化合物、5种二苯甲酮类化合物和2种抗菌药,将5 mL尿液样品用20%(w/v)NaCl水溶液稀释至10 mL,萃取剂750 μL 1,2-二氯乙烷与样品混合后采用玻璃注射器将混合液抽吸3次,使两者充分混匀,形成均匀的乳状液体,萃取时间为30 s,结果显示LOD为0.01～0.30 ng/mL, LOQ为0.03～1.0 ng/mL,所有待测物在1.0～20.0 ng/mL范围内呈良好的线性关系,萃取时间短且萃取富集效果较好。

AA-DLLME的优点在于此法采用空气辅助萃取,代替了常规的人工振荡,缩短了萃取时间,但是一些研究发现,萃取效率并未明显提高[27],目前空气辅助液相微萃取结合新型萃取剂的方法提高了萃取效率。Ferrone等[19]建立了AA-DLLME-SFOD测定医院获得性肺炎患者血浆中抗生素美罗培南、甲硝唑等5种药物的含量,采用30 μL 1-十二烷醇为萃取剂,经过离心、冰浴,得到了凝固的萃取相,萃取时间不超过1 min, 5种药物的富集因子为87～121, LOD为0.001～0.08 μg/mL,萃取效果较好且时间短。除此,共晶溶剂(deep eutectic solvent, DES)等作为萃取剂可与AA-DLLME联用,共晶试剂具有环境友好、萃取效率高等优点[28-30]。

2 分散液液微萃取在生物样品中的应用

生物样品由于待测物含量低且内源性物质干扰多,使得其中的药物定量检测难度大,因此生物样品的前处理至关重要。相对于常规萃取方法LLE、SPE等,DLLME利用少量的萃取剂与分散剂混合萃取,具有较好的富集效果,大大减少了有毒有害的有机溶剂用量,并且发展出不同模式的DLLME,在生物样品前处理中的应用越来越广泛。以下将针对血液、尿液、唾液、脏器组织、头发5种常见的生物样品介绍DLLME在生物样品中的应用。

2.1 血液

血液是由血浆和血细胞组成的,血液中的药物通常指血浆或血清中的药物,药物在血液中有两种存在方式,一是以游离药物形式存在,二是以蛋白结合药物形式存在,目前大多是研究血浆内药物。Taheri等[31]采用DLLME-SFOD法萃取人血浆中的阿托伐他汀,萃取剂为30 μL 1-十一烷醇,分散剂为200 μL乙腈,将两者混合液体迅速注入样品中,形成均匀的小液滴,离心相分离,冰浴相凝固,分离萃取相待其在常温下融化后进样分析。将此法应用于一名服用阿托伐他汀的22岁男性的血样分析,结果显示,血浆中内源性杂质影响较小,灵敏度较高。血液样品中基质干扰较多,为了提高萃取效率,可将多种萃取方法结合使用。Mashayekhi等[32]将SPE与DLLME联合使用测定人血浆中苯二氮卓类药物含量,实验中对比了SPE、DLLME、SPE-DLLME 3种前处理方法,结果显示SPE法的LOD为8.8～167 μg/L, DLLME法的LOD为0.3～0.7 μg/L, SPE-DLLME的LOD为0.07～0.7 μg/L,可观察到不同的萃取方法联合使用对实验灵敏度有极大的改善。

2.2 尿液

药物代谢后主要是通过尿液排出体外,尿液中不仅含有被排泄的药物,还有相关的药物代谢产物,因此,尿样常被用于测定药物及其主要代谢产物,进而研究药物代谢速率与代谢途径等。Zacharis等[33]建立了n-DLLME联合液相色谱-柱后衍生化测定尿液样品中抗病毒药物金刚烷胺,800 μL乙腈和100 μL氯仿分别作为分散剂和萃取剂,对分析物进行在线柱后衍生化处理,通过荧光光谱法测定衍生物含量,结果显示,金刚烷胺富集因子为58, LOD为0.5 μg/L,加标样品回收率为87.5%～113.9%。Farahmand等[34]采用AA-DLLME-SFOD萃取结合紫外-可见光分光光度法测定尿样中的阿替洛尔、卡维地洛和普萘洛尔,在样品中迅速加入125 μL 1-十二烷醇和160 μL 1 000 mg/L Triton X-100水溶液,用注射器迅速吸入、排出此样品混合液10次,经过离心、冰浴,收集凝固的萃取相,放入400 μL 0.01 mol/L盐酸溶液中进行空气辅助液液微萃取(air-assisted liquid-liquid microextraction, AALLME),注射器迅速吸入、排出混合液体,经过离心和冰浴操作后,弃去凝固于液体表面的1-十二烷醇,取下层水相适量进样分析,步骤见图3,结果显示阿替洛尔、卡维地洛、普萘洛尔的富集因子分别为11.24、16.55、14.90, LOD分别为0.09、0.10、0.08 μg/mL。

2.3 唾液

研究表明唾液中药物浓度与血浆中游离药物浓度呈现一定的相关性,且唾液样品采集方便,不会引起患者不适,因此,可用唾液药物浓度测定代替血药测定。唾液样本基质比较简单,适合用DLLME进行前处理。Abujaber等[35]采用IL-DLLME处理人唾液样品,并结合LC-UV-Vis建立了一种测定唾液中可的松和氢化可的松含量的分析方法。选择[C4MIM][PF6]作为萃取剂,甲醇作为分散剂,耗时短且环境友好,可的松和氢化可的松的LOD分别为0.11 μg/L和0.16 μg/L,富集因子分别为6.3和5.0。de Oliveira等[36]建立了n-DLLME结合LC-MS/MS法测定人唾液中17种内分泌干扰物含量的分析方法。采用2 mL丙酮(分散剂)和三氯甲烷(萃取剂)混合物(3∶1, v/v)萃取待测的内分泌干扰物,结果显示LOD为0.01～0.15 ng/mL, LOQ为0.05～0.40 ng/mL,该萃取方法已应用于10例人唾液样本分析,萃取效果较好、灵敏度较高。

2.4 组织

组织中药物含量的测定通常应用于考察药物在组织中的分布情况。Shen等[37]采用UA-LDS-DLLME萃取并结合GC-MS法测定人乳腺肿瘤和周围脂肪组织中的对羟基苯甲酸酯。组织样本匀浆后加入5 mL乙腈-水-15%(w/v)硫酸锌缓冲液(2∶2∶1, v/v/v)进行蛋白沉淀处理,离心后取出上清液,调节pH至7.0,盐浓度至0.2%(w/v),将93 μL 1-癸醇和500 μL甲醇的混合液快速注入样品中,156 W超声44 s,离心3 min,得到位于上层的萃取相,进样分析。结果显示对羟基苯甲酸酯的富集因子为44.9～60.5,样品回收率为79.6%～113.6%, LOD为0.5～1.0 ng/g。He等[38]采用原位衍生化超声辅助液液微萃取结合UHPLC-MS/MS方法测定帕金森大鼠脑透析液中多种神经递质含量,加入低毒性萃取剂溴苯、分散剂乙腈和衍生化试剂赖氨酸罗丹明B磺酰氯(lissaminerhodamine B sulfonyl chloride, LRSC)后进行UA-DLLME,结果显示神经递质的LOD为0.002～004 nmol/L, LOQ为0.007～0.015 nmol/L,提取回收率为94.1%～108.7%,与文献报道的衍生化和不衍生化LC-MS/MS方法相比,检测灵敏度显著提高,且耗时明显缩短。

2.5 头发

通过测定头发中的药物含量可以分析得到患者的长期用药史,但由于样本量少且药物浓度较低,分析难度较大,需要灵敏度高、富集效果好的萃取方法。Vincenti等[39]采用加压液相萃取(pressurized liquid extraction, PLE)联合DLLME技术并结合超高效液相色谱(UHPLC)-高分辨串联质谱技术(high resolution tandem mass spectrometry, HRMS/MS)测定头发中的60种滥用药物。在处理后的头发样品中加入7 mL 0.15 mol/L甲酸缓冲液(pH 3.5)-2-丙醇(80/20, v/v),在150 ℃、10 000 kPa条件下处理7 min,将得到的PLE萃取物离心,分离出5 mL加入1.2 g氯化钠,采用20 μL 1 mol/L氢氧化钠和500 μL碳酸盐缓冲液调节pH至11,将200 μL萃取剂氯仿和500 μL分散剂2-丙醇混合溶液快速加入样品中,经过超声、离心得到萃取相,进样分析。结果显示,头发中60种滥用药物的LOD为0.1～5 pg/mg, LOQ为0.2～50 pg/mg。Talpur等[40]采用超声辅助离子液体液液微萃取处理头发样本,结合FAAS建立了一种测定营养不良儿童头发内铅含量的分析方法。在0.2 g头发样品中加入2 mL HNO3(65%)-H2O2(30%) (2/1, v/v)混合物室温消化10 min,样品过滤稀释后加入2 mL 0.1 mol/L醋酸盐-磷酸盐缓冲液,75 μL离子液体[C4MIM][PF6],于60 ℃热水浴中超声3 min,离心分离得到萃取相,加入反萃取剂0.5 mL 1.5 mol/L HNO3,超声离心后得到萃取相。分析结果显示铅离子的LOD为0.19 μg/L,富集因子为70,与前期报道的实验结果相比,富集效果较好且灵敏度高。

DLLME结合多种检测手段提供了一种简单、快速、高效且环境友好的分析方法,在常见的生物样品中,以尿样的应用最多,其次是血样。本文总结了不同模式的DLLME在多种生物样品分析中的应用情况,具体见表1[6-11,13,14,19-21,23-25,31,34,41-64]。可以看出,该法已应用于免疫抑制剂[8]、非甾体类抗炎药[14]、内分泌干扰物[41]、生物代谢标志物[43,47]、外界致病物[9,44,59,62]、新精神活性物质[45,50]、磷酸二酯酶抑制剂[46]、神经递质及其代谢物[51]、抗高血压药物[57]、药物滥用[58]、抗抑郁药等;应用的检测方法包括GC[9,14,23,42,43,45]、LC[41,44,46,56-61]、MS[8,9,41-46, 48]、毛细管电泳(CE)[49]、UV[47,53,56-61]等,富集因子、提取回收率与灵敏度均较高。

3 结论与展望

分散液液微萃取技术具有富集效率高、易操作、耗时短、成本低、环境友好等优点,在生物样品分析领域中的应用日益增多。在常规分散液液微萃取的基础上,发展了一些新型的萃取剂,如环境友好的绿色溶剂离子液体,萃取相易收集的低密度溶剂,以及密度小且熔点低于常温的悬浮固化萃取剂等;另一方面,为了增强分散效果并减少分散剂的使用,发展了一些辅助分散的手段,包括超声辅助、空气辅助、涡旋辅助等,大大改善了人工振摇辅助分散的效果。分散液液微萃取技术已经应用于生物样品,如血样、尿样、组织等复杂基质中药物的提取分离。但是目前的分散液液微萃取技术仍然以有机溶剂为主,离子液体虽然更环保,但其合成成本较高,而低密度溶剂由于其多为弱极性物质,适用范围较窄;应用方面,对于一些基质比较复杂的样品,DLLME提取效率和净化程度并不理想。预计DLLME今后的发展方向主要为:(1)继续开发安全低毒的新型萃取剂与分散剂,减少其用量,更加绿色环保;(2)发展能够加速分散过程的新技术新方法(如涡旋-超声双分散辅助、磁性泡腾分散辅助等[65,66]),应用于生物样品中,从而实现无分散剂的DLLME过程;(3)针对生物样品分析的基质背景复杂的问题,将DLLME与其他样品前处理技术相结合,应用于复杂基质样品的分离分析,提高DLLME的选择性和萃取效率;(4)针对生物样品分析中样品数量众多的问题,提升DLLME自动化程度,结合多种检测手段构建在线模式,实现采样、萃取、进样、分析一体化,必将大大提高分析通量,并扩大DLLME的应用范围,为复杂生物样品的前处理提供强劲的技术支撑。