高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定克氏原鳌虾中多菌灵残留

李亚梦, 甘金华, 李晋成, 吴立冬, 李 芹, 肖雨诗, 彭 婕, 陈建武, 刘 欢*

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 中国水产科学研究院, 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室, 北京 100141; 3. 中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心, 农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉), 湖北 武汉 430223)

多菌灵(carbendazim)属于苯并咪唑类药物,是一种农业上常用的高效低毒内吸性杀菌剂[1],同时也是苯菌灵、甲基硫菌灵等同类杀菌剂的共同降解物,其作用机理是干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成,影响细胞分裂,起到杀菌作用[2]。在水稻生产过程中,多菌灵广泛用于防治水稻纹枯病[3]、稻瘟病[4]、恶苗病[5]。使用方法主要为拌种、叶面喷洒和土壤处理,从而会对稻田水体和底泥造成污染。有研究表明,多菌灵对水生动物具有一定的毒性[6],随着新型生态循环农业发展模式——稻渔综合种养的推广,其进入水源环境后,会对与水稻共作的克氏原螯虾产生不良影响。

目前多菌灵的检测方法主要有高效液相色谱法[7,8]、液相色谱-串联质谱法[9,10]、免疫分析法[11,12]以及分光光度法[13,14]等。与其他方法相比,液相色谱-串联质谱法对低浓度分析物有较高的灵敏度和选择性。当前,已有相关报道研究了多菌灵在水果[15,16]、蔬菜[17,18]、水稻[19]、土壤[20]、蜂王浆[21]等基质中的残留分析方法,而在水产品中多菌灵的残留检测方法尚未报道。近年来,克氏原螯虾具有较高的经济价值和消费需求,为避免多菌灵通过食物链从水产品转移到人体,给人们带来膳食风险,建立多菌灵在水产品中的检测方法十分有必要。

本文基于液相色谱-质谱联用技术建立了典型杀菌剂多菌灵在克氏原螯虾中的确证性方法。该方法简便、快速、灵敏度高,为提高克氏原鳌虾养殖过程中多菌灵监控能力,保障克氏原鳌虾质量提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

QTRAP5500高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪(美国SCIEX公司); Analyst工作站;W-SPE24手动固相萃取仪(美国Supelcovisiprep公司); AP-9925-3真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司); Buchi R210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); MS200多管漩涡混匀仪(杭州瑞诚仪器有限公司); PL2002分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司); 4-20R台式高速冷冻离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司); N-EVAP 112水浴氮吹仪(美国OA公司); SB-5200DTN超声波清洗机(宁波新芝生物科技公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

多菌灵(纯度99.6%)、多菌灵-D4(纯度98.2%)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司);盐酸(分析纯,北京化工厂);氨水、无水硫酸钠、氢氧化钾、磷酸氢二钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲酸(HPLC级,上海安谱实验科技股份有限公司);甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(HPLC级,德国CNW公司);聚四氟乙烯(PTFE )亲水滤膜(0.22 μm,上海安谱实验科技股份有限公司);混合阳离子交换小柱(MCX)固相萃取柱(3 mL/60 mg,美国Waters公司);实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的制备

标准储备液:分别精确称取5.02 mg多菌灵和5.09 mg多菌灵-D4标准品,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成100 mg/L的多菌灵标准储备液和多菌灵-D4标准储备液,转移至棕色玻璃瓶中,于-20 ℃下避光保存。

标准工作液:分别准确吸取多菌灵和多菌灵-D4标准储备液适量,用甲醇稀释,分别配制成1 mg/L的多菌灵和100 μg/L的多菌灵-D4标准工作液,于-20 ℃下避光保存。

1.3 样品处理方法

1.3.1制备

克氏原鳌虾去头、去壳、去虾线,取可食肌肉部分经过匀浆,密封,保存在-20 ℃冰箱中。

1.3.2提取

将1.3.1节制备得到的虾糜于室温下解冻后,准确称取2.00 g(精确至0.01 g)试样于50 mL具塞离心管中,加入50 μL 100 μg/L多菌灵-D4的标准溶液,涡旋混匀30 s,避光放置15 min。加入15 mL乙酸乙酯提取液和0.5 mL 1 mol/L磷酸氢二钾,涡旋混匀1 min,超声提取10 min,加入5 g无水硫酸钠,涡旋1 min。4 500 r/min离心5 min,取上清液于100 mL鸡心瓶中,重复提取一次,合并两次提取液,于40 ℃水浴温度下旋转蒸发至干,加5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液溶解残渣,并转移至50 mL具塞离心管中,待净化。

1.3.3净化

MCX柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL 2%(v/v)氨水进行活化。将5 mL上述样品盐酸溶液转移至已经活化处理后的MCX小柱上,弃掉流出液。依次用2 mL 2%(v/v)氨水、2 mL 0.1 mol/L盐酸和3 mL甲醇淋洗MCX小柱,让洗涤液完全流出柱子,减压抽小柱至近干。在不抽真空的情况下用3 mL 8%(v/v)氨水甲醇洗脱,收集洗脱液,氮吹浓缩至干,用乙腈-水(1∶4, v/v)定容至1 mL,超声5 min,加1 mL正己烷脱脂,4 500 r/min离心5 min,用1 mL注射器吸取下层清液,经0.22 μm滤膜过滤后,取5 μL进行LC-MS/MS分析,内标法定量测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱温:40 ℃;流动相A:水;流动相B:乙腈;进样量:5 μL;流速:400 μL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 85%A; 1.0～5.0 min, 85%A～20%A; 5.0～6.0 min, 20%A; 6.0～6.1 min, 20%A～85%A; 6.1～7 min, 85%A。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源:ESI;离子化模式:正离子模式;扫描方式:多反应监测模式(MRM);离子化电压(IS): 5 500 V;离子传输毛细管温度(TEM): 550 ℃;喷雾气(GS1)和辅助气(GS2)均为高纯氮气,分别为344.75 kPa和379.23 kPa;气帘气(CUR)为零级空气,压力为275.80 kPa;入口电压(EP): 26 V;出口电压(CXP): 13 V。化合物的监测离子对(m/z)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等其他质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的确定

使用50%(v/v)甲醇水溶液作为溶剂,配制20 μg/L的多菌灵标准溶液,采用针泵恒流进样的方式,进行质谱参数优化。在正离子全扫描模式下,首先进行一级质谱扫描(Q1 scan),获得多菌灵的母离子信息。其次,设定一定的碰撞能量,使用碎片离子扫描(product ion scan)获得多菌灵的子离子信息。随后对去簇电压和碰撞能量进行优化,以获得最终的质谱方法。质谱参数优化结果见表1。

表 1多菌灵、多菌灵-D4的监测离子对、去簇电压和碰撞能量

Table 1Monitoring ion pairs (m/z), declustering potentials (DP) and collision energies (CE) of carbendazim and carbendazim-D4

CompoundParent ion(m/z)Product ion(m/z)DP/VCE/VCarbendazim192.1160.1∗8426192.1132.18440Carbendazim-D4196.0164.0∗8428196.0136.18442

*Quantitative ion.

2.2 色谱条件的确定

通过改变流动相体系的类型和洗脱梯度程序,研究了甲醇-水、甲醇-5 mmol/L醋酸铵、乙腈-水、乙腈-5 mmol/L醋酸铵等流动相体系对多菌灵的峰形、峰宽、保留时间和信号强度的影响。研究结果表明,当选取甲醇-水为流动相时,半峰宽较宽,低浓度峰拖尾现象严重;当分别选取甲醇-5 mmol/L醋酸铵和乙腈-5 mmol/L醋酸铵为流动相时,保留时间较长,信号强度较低;当选择乙腈-水为流动相时,结合梯度洗脱方式选择性地让流动相进入质谱离子源,可将多菌灵与基质干扰峰分开且降低基质对质谱信号的干扰,多菌灵、多菌灵-D4的峰形、半峰宽、保留时间和信号强度均比较好,因此选择乙腈-水作为流动相。

在优化的流动相条件下,研究进样量和流速对分离效果的影响。当进样量为5 μL,流速为200、300、400 μL/min时,随着流速的增大,柱压升高,实现了目标化合物在色谱柱中快速分离的效果,峰宽较窄,峰形尖锐。当增大进样量为10 μL,流速为200、300、400 μL/min时,随着流速的增大,保留时间提前,与进样量为5 μL相比洗脱的目标峰呈宽峰。因此最终确定流动相为乙腈-水,进样量为5 μL,流速为400 μL/min。在优化的质谱和液相色谱条件下多菌灵及多菌灵-D4标准溶液的色谱图见图1。

图1 多菌灵和多菌灵-D4标准溶液的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the standard solutions of carbendazim and carbendazim-D4

2.3 提取条件的优化

鉴于碱性条件下多菌灵在有机溶剂中有较好的溶解度,为了使克氏原螯虾中残留的多菌灵有好的提取效果,通过空白克氏原螯虾肌肉加标回收试验比较了乙腈、乙酸乙酯、乙腈-磷酸氢二钾、乙酸乙酯-磷酸氢二钾、含2%(v/v)氨水的乙酸乙酯作为提取剂时,提取剂的提取效率。结果表明,乙腈作提取剂时,回收率较低(72.6%),分析其原因是乙腈与样品中的水互溶,样品脱水、变性、抱团成块;乙酸乙酯作提取剂时,回收率小于90%;用含2%(v/v)氨水的乙酸乙酯提取时,回收率大于120%,分析其原因是杂质多,本体干扰严重。在提取剂乙腈和乙酸乙酯中加入磷酸氢二钾时回收率均大于90%,但是用乙腈-磷酸氢二钾作为提取剂时,旋干耗时长且存在暴沸现象,浓缩过程难于控制;而用乙酸乙酯-磷酸氢二钾作提取剂时,回收率为95.6%,耗时比乙腈短,选择性好,本体干扰少,因此确定提取条件为15 mL乙酸乙酯-0.5 mL 1 moL/L磷酸氢二钾重复提取两次。

2.4 净化条件的优化

2.4.1净化材料的优化

本研究分别使用C18粉(德国CNW公司)、GCB粉(德国CNW公司)、PSA粉(北京长丰未来科技有限公司)净化浓缩后用乙腈-水(1∶4, v/v)复溶的溶液,同时分别用HLB小柱(3 mL/60 mg,美国Waters公司)、MCX小柱对含目标物的盐酸溶液进行净化萃取,比较其净化效果。结果见图2。由于多菌灵具有两性化合物的性质,所以在使用MCX净化时,富集净化效果更好。因此净化材料选定MCX。

图2 不同净化材料对克氏原螯虾中多菌灵回收率的影响(n=6)Fig. 2 Effect of different purification materials on the recoveries of carbendazim in Procambarus clarkii (n=6) PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black; MCX: mixed-mode cation exchange solid phase extraction column.

2.4.2洗脱剂的优化

SPE柱确定为MCX后,将吸附有多菌灵的MCX柱分别用3 mL含6%(v/v)、8%(v/v)、10%(v/v)氨水的甲醇混合溶液进行洗脱,洗脱液经氮气吹干后,用1 mL乙腈-水(1∶4, v/v)复溶液溶解,进样测定,通过比较回收率大小,确定最适合的洗脱剂为8%(v/v)的氨水甲醇,回收率见表2。

表 2 采用不同体积分数的氨水甲醇洗脱时克氏原螯虾中多菌灵的回收率(n=6)

2.4.3洗脱体积的优化

分析比较了洗脱体积为2、3、4 mL时多菌灵的回收率,结果表明,当洗脱体积为3 mL和4 mL时,回收率均大于90%;当洗脱体积为4 mL时,氮吹耗时较长,因此洗脱体积确定为3 mL。

2.5 方法验证

2.5.1方法的线性关系和检出限

分别准确吸取质量浓度为0.5、 1.0、 2.0、5.0、 10.0、 20.0、50.0 μg/L的多菌灵标准溶液,同时吸取一定质量浓度的内标多菌灵-D4溶液,使内标浓度均为5 μg/L。在优化后的LC-MS条件下进行测定。以多菌灵与内标多菌灵-D4的色谱峰面积比值为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, μg/L),考察多菌灵与内标多菌灵-D4的峰面积比值与质量浓度的线性关系,并以此建立标准曲线。可得到线性方程为Y=0.018 42+0.199 88X,多菌灵在0.5～50.0 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.998 5。

在不含目标化合物的克氏原螯虾组织中添加一定含量的多菌灵标准溶液,并对其进行分析,根据7个空白样品组织基线噪音的平均值,分别以定量离子对3倍信噪比(S/N)、10倍信噪比(S/N)的响应值对应的含量作为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),测定结果表明多菌灵的LOD值为0.25 μg/kg,多菌灵的LOQ值为0.50 μg/kg。色谱图见图3。

图3 加标克氏原螯虾样品的色谱图Fig. 3 Chromatograms of spiked Procambarus clarkii samples

表 3 克氏原螯虾中多菌灵的回收率和精密度(n=6)

2.5.2方法的回收率和精密度

在克氏原鳌虾空白肌肉组织中分别添加低、中、高4个浓度水平的多菌灵标准品,分别为0.5、 1.0、 5.0、50.0 μg/kg,每个浓度做6个平行,设置一组空白对照,按1.3节前处理条件处理后测定并计算回收率和相对标准偏差。结果见表3。从表3中可以看出,4个浓度水平下多菌灵的加标回收率为83.9%～105.5%,方法的相对标准偏差为1.1%～3.2%,精密度良好,其回收率和精密度均能够满足多菌灵的检测要求。

2.6 基质效应

按照1.3节样品前处理方法制备空白基质液,配制基质标准工作曲线。结果表明,多菌灵在0.5～50.0 μg/L范围内线性相关,线性方程为Y=0.180 9X+0.018 51,r2为0.999 6。用基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率之比(M)对基质效应进行评价,结果表明,M=0.905,其比值接近1,说明基质效应较小,因此可选择溶剂配制的标准曲线进行定量分析。

2.7 实际样品测定

分别从菜市场和稻虾综合种养试验田中随机抽取10批克氏原螯虾样品,按照1.3节前处理方法处理后对实际样品进行测定分析,其中2批有检出(含量>LOD)。检出样品中多菌灵含量分别为1.80 μg/kg和8.55 μg/kg,检出率为20%。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定克氏原螯虾肌肉组织中多菌灵的分析方法。该方法采用乙酸乙酯提取,MCX固相萃取柱净化提取液的手段,有效地提高了检测方法的回收率和灵敏度,适用于克氏原螯虾肌肉组织中多菌灵的检测。最新食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》[22]中还未对甲壳类动物中多菌灵的残留制定最大残留限量,因此需要更加深入研究多菌灵对甲壳类动物的潜在危害风险评估。