超高效液相色谱-串联质谱法快速测定鱼和虾中多类禁、限用兽药残留

陈兴连, 林 涛, 刘兴勇, 梅文泉, 王 丽,耿慧春, 程 龙, 汪禄祥*

(1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 农业农村部农产品质量监督检验测试中心(昆明), 云南 昆明 650205; 2. 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司, 上海 200335)

随着现代水产养殖业呈集约化和规模化发展,水产生物疫情的爆发频率也逐渐增高,为了治疗和预防水产生物病虫害,以及减少高密度饲养带来的风险,养殖过程中常使用磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、硝基呋喃类等抗生素及三苯甲烷类兽药。这些药物抗菌效果好,价格低廉,部分药等效替代品少,而使用者和经营者对这些药物的毒性和危害认识不足,导致超量和超种类的滥用、误用、违规使用,以及不遵守休药期等现象屡禁不止[1-4],由此引起水产品中兽药的残留、超标现象时有发生。大量兽药污染的水产品经食物链进入人体后,会破坏人的造血系统,导致毒性损伤、激素障碍变态反应、过敏反应及细菌耐药性等危害[5,6]。复旦大学相关研究人员还认为抗生素的暴露模式可能是促进脂肪生成并导致儿童肥胖的危险因素之一[7]。我国农业部235号公告将三苯甲烷类、氯霉素和硝基呋喃类列为水产养殖禁用药,而磺胺类、喹诺酮类、甲砜霉素、氟甲砜霉素列为水产养殖限用药。目前,食品安全监督机构以及相关企业将这5类兽药作为日常检测项目进行重点监控。孔雀石绿及硝基呋喃类药物在动物体内迅速代谢,而与蛋白结合的代谢物在生物体内能长期稳定存在[8],因此常通过检测其代谢物以反应样品真实的药物残留情况。

测定兽药残留的现有标准方法[9-15]多按照化学结构类似的同族或单一药物来测定。虽样品前处理方法适合多类基质,但完成一个样品中不同类兽药检测需经几次前处理,检测成本高,周期长,造成仪器设备、人员浪费,也难以满足愈来愈多突发事件的应急监控需要[16,17]。超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)在满足多组分同时检测的情况下仍具有选择性强、基质干扰小、灵敏度和检测效率高等优势,是近几年来水、土、动物源性食品及排泄物等基质中多类兽药残留快速测定的首选[18-25]。尽管同时测定水产品中多类兽药残留也有较多文献报道[26-28],但同时测定磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、硝基呋喃类代谢物、孔雀石绿、隐色孔雀石绿的文献鲜有报道,且国家农产品质量安全例行监测要求水产品(鱼、虾)测定这5类兽药。因此,迫切需要建立水产品中这5类兽药的快速检测方法。

本研究通过优化样品前处理方法、色谱及质谱条件,建立了同时提取净化-超高效液相色谱-串联质谱快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物、喹诺酮类、磺胺类、三苯甲烷类、氯霉素类共5类28种药物的新方法。该方法对提高水产品监管工作效率、节约检测成本、保障食品安全具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290超高效液相色谱仪、ZORBAX C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(美国Agilent公司); QTRAP 5500三重四极杆/线性离子阱质谱仪(美国AB Sciex公司);涡旋振荡器(美国Thermo公司); JD200-2电子天平(沈阳龙腾电子有限公司); TGL-15 B型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)。

表 1 28种兽药、12种同位素内标的质谱参数

DP: declustering potential; CE: collision energy; * quantitative ion.

本实验所用溶液标准物质(见表1)均购于农业农村部农产品质量标准研究中心(北京), 7种喹诺酮类、12种磺胺类、4种硝基呋喃类代谢物的质量浓度均为10 mg/L, 3种氯霉素类药物的质量浓度均为100 mg/L,其余物质的质量浓度均为5 mg/L。

甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯,美国Sigma公司);乙酸铵、氯化钠、正己烷(分析纯,上海国药集团);磷酸氢二钾(分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司);纯净水(杭州娃哈哈公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18、氨基键合硅胶填料(NH2, 50 μm)(中国迪马科技有限公司);二甲亚砜(分析纯,天津风船化学试剂科技有限公司); 2-硝基苯甲醛(纯度>98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);盐酸(优级纯,上海国药集团)。

1.2 标准溶液配制

用甲醇稀释各兽药溶液标准物质及内标物质:氯霉素、喹诺酮类、磺胺类、硝基呋喃类代谢物配制成质量浓度为1.0 mg/L,甲砜霉素和氟甲砜霉素配制成质量浓度为10.0 mg/L,其他物质配制成质量浓度为0.5 mg/L的标准储备液,于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1提取

称取5.00 g(精确至0.01 g)均质试样,置于50 mL塑料离心管中,依次加入13.0 mL 0.2 mol/L盐酸和0.05 mL 0.16mol/L 2-硝基苯甲醛溶液,置于37.0 ℃恒温振荡器中保持16 h,取出冷却至室温,再加入6～8 g氯化钠、15.0 mL乙腈,涡旋提取5～7 min,以5 000 r/min离心3 min,取出上清液,再加入15.0 mL乙腈重复提取一次,合并两次提取液,待净化。

1.3.2净化

向提取液中加入5～6 mL正己烷,涡旋1 min,以5 000 r/min离心3 min,取出乙腈层浓缩至干,加入1.0 mL甲醇复溶,待净化。

取50 mg C18、30 mg PSA及60 mg NH2吸附材料,置于50 mL离心管中,加入2.0 mL甲醇,涡旋30 s后去除上清液,将上述1.0 mL待净化溶液转移至离心管中,涡旋1 min,取上清液过0.22 μm滤膜,待UHPLC-MS/MS测定。

1.4 分析条件

1.4.1色谱条件

采用正交试验方差分析方案[1]，研究播种架倾角、种勺线速度、种勺空间尺寸与播种架播种性能指标之间的关系，对数据进行分析处理，分析影响播种质量上述3因素中的主要因素；再用综合加权分析法对数据进行优化，确定最佳的参数范围。

色谱柱:ZORBAX C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温:35 ℃;流速:0.2 mL/min;进样量:2.0 μL。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素:流动相A为水,B为甲醇。梯度洗脱程序为0～3.0 min, 5%B～95%B; 3.0～6.0 min, 95%B; 6.0～6.5 min, 95%B～5%B; 6.5～8.5 min, 5%B。

其他化合物:流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸铵), B为乙腈。梯度洗脱程序为0～3.0 min, 5%B～30%B; 3.0～4.0 min, 30%B～40%B; 4.0～6.0 min, 40%B～95%B; 6.0～8.0 min, 95%B; 8.0～8.2 min, 95%B～5%B; 8.2～10.0 min, 5%B。

1.4.2质谱条件

离子源:ESI源;离子源温度:550 ℃;喷雾气(GS1)压力:0.379 MPa;辅助加热气(GS2)压力:0.379 MPa;气帘气压力:0.241 MPa。氯霉素类药物为负离子模式扫描,喷雾电压:-4 500 V;监测模式:-MRM;磺胺类、喹诺酮类、孔雀石緑、隐色孔雀石緑、硝基呋喃类代谢物为正离子模式扫描,喷雾电压:5 500 V;监测模式:+MRM。其他质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

2.1.1质谱条件优化

质谱条件中的去簇电压和碰撞能量对离子丰度具有较大影响,对方法灵敏度有决定性作用。去簇电压过低时难以实现目标物与被其吸附的溶剂分子的去簇;过高时离子碎裂,导致源内裂解。碰撞能量过高时,由母离子生成的碎片过多,子离子响应过低;碰撞能量过低时,不能生成所需的子离子。同一离子在不同型号仪器上所需的去簇电压和碰撞能量也不尽相同,本实验通过针泵以流动注射的方式对1.2节配制的标准溶液进行分析,为每个待测药物选取响应最高的两对离子对及相应的最佳去簇电压和碰撞能量,并根据各离子对的响应高度确定定量与定性离子对,相关参数见表1。

2.1.2色谱条件优化

流动相对化合物的离子化效率、色谱峰形、峰高和分离效果都有较大影响。由于这5类药物结构中含有叔氨基、强碱性基团等,易与色谱填料中残余的硅醇基产生氢键作用,造成色谱峰拖尾、展宽,以及保留时间漂移等现象[1],为了尽可能提高药物分离度,实现结构相似化合物及同分异构体的分离,减少杂质峰干扰,提高化合物响应,实验对流动相进行了优化,选择甲醇、乙腈为有机相,同时在水相中添加甲酸、乙酸铵,考察分离效果。

实验还考察了以乙腈为有机相,水相中分别加入乙酸铵、甲酸及二者均加入时4类药物的色谱行为及灵敏度。结果表明,水相中只加入乙酸铵或甲酸时部分药物峰响应较低,部分峰形差且展宽严重,乙酸铵和甲酸均加入时4类药物的峰形及灵敏度均较好。可能原因是甲酸可提供ESI源在Q1四极杆内离子化所需的H+,促进了[M+H]+峰形成的同时抑制了目标化合物[M+Na]+峰的形成。此外,流动相在弱酸性环境条件下加入适量乙酸铵可以再次提高待测物离子化效率,且乙酸铵的加入还能够调节溶液的离子强度,致使色谱峰形更加对称[4,7]。经对甲酸体积分数和乙酸铵浓度的考察,最终选择乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸铵)为流动相。

(2)在ESI-模式下测定3种氯霉素类药物。采用乙腈为流动相测定时,草鱼等部分样品中药物受杂质峰干扰大于甲醇。此外,水相中无论加氨水还是乙酸铵,样品中药物响应均较纯水时低。因此最终选择甲醇-水为流动相。

优化后的28种药物的MRM色谱图见图1。

图2 不同水解液对罗非鱼中28种兽药峰响应强度的影响Fig. 2 Effect of different hydrolysates on the peak response intensities of the 28 veterinary drugs in tilapia samples

图1 28种兽药的MRM总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of the 28 veterinary drugs in MRM mode a. sulfonamides, quinolones, malachite green, leucomalachite green and nitrofuran metabolites; b. chloramphenicols.

2.2 样品前处理条件

喹诺酮类、硝基呋喃类代谢物等部分药物在肌体内与蛋白质具有较强的结合作用,但经适当的酸或碱水解后可游离出来[29,30]。因此本实验通过选择水解液、优化提取条件和净化材料等将水产品中5类药物同时提取和净化。

2.2.1样品水解液

以罗非鱼为例,添加同等浓度的兽药标准溶液,然后分别用10.0 mL 0.2 mol/L盐酸溶液、甲酸溶液及1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液水解,衍生化反应后提取、测定,考察各药物的峰响应情况。实验结果表明,采用甲酸溶液水解时,大部分药物的响应低于采用磷酸氢二钾及盐酸溶液时的响应。采用磷酸氢二钾溶液水解时,氨基脲不出峰,且氯霉素类、孔雀石绿及代谢物、大多喹诺酮类、硝基呋喃类代谢物的响应低于盐酸溶液(见图2)。因此本实验最终选择0.2 mol/L盐酸为样品的水解液。

实验还考察了0.2 mol/L盐酸溶液的加入体积(5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0和17.0 mL)对28种兽药提取效率的影响。结果表明,当盐酸加入量少时,部分药物及内标物的基质效应(ME)较强,提取效率偏低,氯霉素、AMOZ等受杂质峰干扰较大。随着加入盐酸体积的增大,杂质干扰逐渐减小,大多药物及内标物的提取效率逐渐增高,当盐酸用量为13.0 mL时，大多数药物回收率达到最佳且干扰最小,当盐酸用量超过13 mL时,由于水相过多不利于部分药物提取,导致提取效率降低。综合考虑各种药物提取效率及杂质干扰情况,最终确定水解液体积为13.0 mL。

2.2.2提取条件优化

多类残留药物同时检测的难点在于提取试剂种类、提取试剂酸碱度、提取次数的选择。标准方法[15]测定硝基呋喃代谢物时,衍生化反应后需将样品的pH值调至7.0～7.5,因此本实验考察了磷酸氢二钾溶液加入量与提取试剂、提取次数3个因素对28种药物回收率的影响,每个因素取3个水平进行正交实验(见表2)。

表 2 正交实验条件

结果表明,对于磺胺类、喹诺酮类、三苯甲烷类、氯霉素类4类药物而言,提取次数2次最好,其中部分药物提取1次时回收率只有50%左右,而提取3次干扰杂质峰较多;磷酸氢二钾溶液加入0 mL时回收率最好,加入13 mL和26 mL时回收率相差不大;采用提取试剂乙腈时回收率最好,因此上述4类药物的最优方案为A2B1C2。对于硝基呋喃类代谢物,以上因素组合的27种方案中,采用A1B2C2与A2B1C2时,药物的回收率及峰响应高度均优于其他25种方案,虽A1B2C2部分药物响应值略高于A2B1C2,但回收率采用内标法计算,二者相差不大,且检出限仍低于标准方法[15]。通过综合分析,最终确定同时提取28种药物的提取方案为A2B1C2，即采用乙腈提取2次。

由于样品加入13.0 mL盐酸水解时将大量的水带入了提取液中,而乙腈与水混溶,若不将水去除,则难以将提取液浓缩至干,因此于样品中加入提取试剂的同时再加入6～8 g氯化钠至水相饱和,离心后取乙腈浓缩。与标准法[12-14]相比,不仅可大大减少浓缩时间,且由于在盐析作用下,提取液中大量的杂质沉淀于水相,因此还避免了浓缩时大量起泡的缺陷及泡沫溢出对目标物带来的损失,也减少了杂质对仪器的污染及对药物峰的干扰。

2.2.3净化条件优化

样品采用1.3.1节方法提取后将提取液浓缩至近干,加1.0 mL甲醇定容,过膜后上机测定。结果显示,部分药物回收率超出70%～120%范围;部分样品中氨基脲、氯霉素、氟甲砜霉素的色谱响应较低且受杂质峰干扰严重;不同批次的草鱼、鲤鱼中隐色孔雀石绿色谱响应的重复性较差。可能原因是基质中的杂质与目标物相互竞争电离或目标物随基质共流出所致[31],而选择合适的净化方式及净化材料除去杂质可降低基质效应,减少共流出。

图3 去除凝胶状物(a)前、(b)后草鱼中氯霉素的色谱图Fig. 3 Chromatograms of chloramphenicol in grass carp (a) before and (b) after removing gelatinous substance

本文考察了正己烷液液萃取及分散固相萃取净化的效果。结果表明,经正己烷净化后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的回收率有较大提高,实验还观察到,提取液加入正己烷，经涡旋、离心后离心管底部聚集了一层凝胶状物质,将去除凝胶状物前、后的色谱图进行对比,发现去除凝胶状物后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的色谱响应显著增高,而干扰峰大大降低,从而推测氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的干扰峰及基质抑制效应是该凝胶状物所致。以草鱼中氯霉素为例的色谱图见图3。

此外,由于C18、PSA、NH2对样品中的蛋白质、脂类、脂肪酸及强极性杂质等有较好的吸附效果,实验根据样品基质的特点,将正己烷净化后的提取液浓缩至近干,甲醇定容后再加入不同比例的C18、PSA与NH2材料(三者混合后加2.0 mL甲醇润洗,去除上清液)分散固相萃取净化,当三者用量分别为50、30和60 mg时,隐色孔雀石绿的色谱响应值趋于稳定,28种兽药回收率均在70%～120%范围内。

因此,本实验最终选择向提取液中加入5～6 mL正己烷,经涡旋、离心、去除正己烷及凝胶状物后再采用50 mg C18、30 mg PSA和60 mg NH2填料进行分散固相萃取净化。

表 3 28种兽药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

y: peak area ratio of analyte to the internal standard;x: mass concentration of analyte, μg/L.

2.3 方法学评价

2.3.1基质效应

基质效应是影响结果准确性的一个重要因素,常被用于评价样品前处理方法,基质效应越强,方法的准确性越低。本文以例行监测抽样数量较大的鲤鱼、草鱼、罗非鱼、对虾等8种阴性样品(下同)为基质,通过(基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1)×100%来计算28种兽药的基质效应,以评价基质中干扰物对目标分析物信号的影响。结果表明,28种兽药中,大多数兽药的|ME|在0～20%之间,为弱基质效应,约3%兽药的|ME|在20%～50%之间,为中等基质效应(见附表1,详见https.//www.chrom-China.com)。表明采用该方法测定鱼、虾中本实验考察的28种残留兽药时基质干扰较小。

2.3.2线性范围和检出限

配制5类兽药的系列标准溶液,以目标化合物定量离子与其内标物峰面积之比对相应的质量浓度进行线性回归,同时以阴性鱼和虾样品为基质,以3倍和10倍信噪比对28种药物进行检出限和定量限的考察,结果见表3。28种兽药在各自范围内线性关系较好,相关系数(r)>0.99,检出限和定量限分别为0.1～0.8 μg/kg和0.3～2.7 μg/kg,与标准方法[12-15]相比,本方法具有更高的检测灵敏度。

2.3.3回收率和精密度

分别添加约1、5、20倍定量限水平的28种混合标准溶液于鱼和虾阴性样品中,进行加标回收率试验,每个样品基质做6次平行试验,计算其平均回收率及相对标准偏差(见附表2)。结果表明,5类兽药的平均回收率为70.0%～120%,相对标准偏差为0.9%～10.0%。

2.4 实际样品检测

为了进一步验证方法的可行性,应用所建立的方法对经标准方法测定有恩诺沙星(54.3 μg/kg)、AOZ(0.34 μg/kg)、SEM(0.79 μg/kg)检出的鲫鱼、鲤鱼、虾样品进行检测,定性结果与标准方法相同,其中恩诺沙星、AOZ及SEM含量分别为54.9、0.31和0.69 μg/kg,表明本方法可用于鱼、虾中5类禁、限用兽药的测定。

3 结论

本文建立方法通过一次前处理完成了不同性质的5类兽药的提取和净化,解决了水产品例行监测完成这5类药物测定需采用4种前处理及仪器分析方法的难题,可在短时间内完成大批量样品的检测,大大降低了检测成本,结果准确可靠,可为食品检验监督机构对鱼、虾中禁、限用兽药残留的测定提供更简便、快捷、廉价的技术支持。