PCOS患者血清微小RNA-146a、性激素及子宫内膜容受性与妊娠关系

李爱香 李永乐 季清云 郭伟光

河南省人口和计划生育科学技术研究院，国家卫生健康委出生缺陷预防重点实验室(郑州，450000)

多囊卵巢综合征(PCOS)主要特征为长期稀发排卵和(或)无排卵及高雄激素血症，是排卵障碍性不孕症的主要原因。研究发现微小RNA-146a(mir-146a)在PCOS患者血清和卵泡液中大量存在，其异常表达参与了PCOS的发生发展[1]。相关研究报道[2]，雌激素水平紊乱会抑制卵巢发育或排卵，导致PCOS患者不孕。子宫内膜容受性包括子宫内膜螺旋动脉搏动指数(PI)、阻力指数(RI)及子宫内膜厚度(Em)等，在雌激素作用下可随月经呈周期性变化，影响胚胎着床[3-4]。但mir-146a、雌激素及子宫内膜容受性与PCOS关系尚不十分明确。本研究通过检测女性血清mir-146a水平、雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)及卵泡刺激素(FSH)水平，及子宫内膜容受性指标PI、RI、Em，分析血清mir-146a、雌激素水平及子宫内膜容受性与PCOS关系。

1 资料与方法

1.1 基本资料

选取2016年9月-2018年9月本院附属医院收治的140例PCOS患者为PCOS组。纳入标准：①符合PCOS临床诊断标准[5]；②已婚育龄妇女，有正常性生活；③入组前未接受治疗；④临床资料完善。排除标准：①先天性卵巢发育异常；②伴有甲状腺疾病、高泌乳素血症等内分泌疾病；③对本研究治疗药物过敏；④严重肝、肾功能障碍；⑤妇科肿瘤病史。另选同期因排卵障碍接受治疗的非PCOS患者110例为对照组。本研究符合本院伦理委员会要求，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 治疗方法及样本采集

所有患者均接受促排卵治疗。患者分别于月经周期或黄体酮撤退性出血第3 d开始，口服氯米芬(西南药业股份有限公司， 50 mg)，50 mg/d，连续用药5 d；月经第8天，肌注人绝经期尿促性腺激素(丽珠集团丽珠制药厂，75 IU)，75 IU/d，根据卵泡发育情况决定用药剂量，当卵泡直径≥18 mm，尿LH(+)时，肌注绒毛膜促性腺激素针(丽珠集团丽珠制药厂，2000 IU)，6000 IU扳机，围排卵期同房。分别于排卵后6～8 d清晨抽取空腹外周静脉血离心取上清液， -80℃保存备用。

1.3 血清mir-146a测定

利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清mir-146a水平。按照TRIzol总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取血清总RNA，分光光度计检测其纯度，并按逆转录试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)逆转录为cDNA。以U6为内参进行扩增，引物均由南京科佰生物科技有限公司合成。mir-146a正向引物5'-GGAGACATGAGAGCTGCCAAC-3'，反向引物5'-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反应条件：94℃、3 min，92℃、30 s，60℃、30 s，75℃、30 s，共40个循环。每样品设6个复孔，反应结束后采用2-△△Ct计算血清mir-146a相对表达量。

1.4 血清雌激素及子宫内膜容受性指标测定

采用化学发光免疫分析法检测血清E2、LH及FSH水平。阴道B超检测患者子宫内膜容受性，观察指标为子宫内膜螺旋动脉PI、RI及Em。

1.5 妊娠的判断及随访

于排卵后第14 d检测血清人绒毛膜促性腺激素，当人绒毛膜促性腺激素明显升高为生化妊娠；排卵后30～35 d阴道B超提示有妊娠囊，即确定临床妊娠。通过门诊对入组患者随访1年，截止至2019年9月30日，记录随访期间患者妊娠情况，包括体质量指数(BMI)、空腹血糖、孕周、早产儿及不良妊娠情况，使用胰岛素抵抗的稳态模型(HOMA-IR)检测胰岛素抵抗(IR)。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床情况

PCOS组年龄(29.0±4.0)岁(21～37岁)，BMI(24.3±2.1)kg/m2(20.2～27.3 kg/m2)，PCOS病程(5.2±1.2)年(2～7年)。对照组年龄(29.1±4.1)岁(20～37岁)，BMI(24.2±2.2)kg/m2(19.9～27.1 kg/m2)。两组年龄和BMI比较无差异，两组患者配偶精液指标比较无差异(均P>0.05)。

2.2 血清mir-146a及性激素水平比较

PCOS组血清mir-146a及LH、FSH水平均高于对照组，E2水平低于对照组(均P<0.05)。见表1、图1。

表1 两组血清mir-146a及性激素水平比较

M:DNA Marker 600；C：对照组；1～6：PCOS组mir-146a 6孔重复

2.3 子宫内膜容受性指标比较

PCOS组子宫内膜容受性指标PI、RI均高于对照组，Em低于对照组(均P<0.05)。见表2。

2.4 PCOS患者妊娠结局与各指标

根据妊娠情况将140例PCOS患者分为妊娠组、非妊娠组。非妊娠组血清mir-146a及LH、FSH水平均高于妊娠组， E2水平低于妊娠组(均P<0.05)；子宫内膜容受性指标PI、RI等均高于妊娠组，Em低于妊娠组(P<0.05)。见表3。

表2 两组子宫内膜容受性指标比较

表3 PCOS患者妊娠结局与各指标比较

2.5 妊娠结局比较

BMI、空腹血糖、HOMA-IR在对照组、妊娠组与非妊娠组依次升高(P<0.05)；与对照组相比，妊娠组孕周降低，早产儿、胎死宫内比例上升(P<0.05)。见表4。

表4 各组妊娠结局比较

2.6 影响PCOS患者治疗后妊娠结局的多因素分析

经多因素logistic回归分析发现，mir-146a、E2、LH、FSH、PI、RI、Em均是影响PCOS患者治疗后不能妊娠的独立危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响PCOS患者治疗后不能妊娠的多因素logistic回归分析

3 讨论

PCOS发病原因复杂。研究发现PCOS患者经治疗后排卵率可达90%，妊娠成功较多[6]。因此，寻找与PCOS发生发展相关指标，可为个体化治疗PCOS提供帮助，提高妊娠率。

微小RNA(miRNA)在生物体胚胎发育等多种生理、病理过程中发挥至关重要作用。mir-146a作为miRNA家族重要成员之一，异常表达与胰岛素抵抗发生有关[7]。Salimi-Asl等[8]研究发现，PCOS小鼠模型中mir-146a表达明显升高，其水平异常升高可能是PCOS发生的主要原因之一。相关研究发现[9]，排卵功能障碍患者子宫内激素环境发生变化，雌激素水平异常，可能导致PCOS的发生发展。E2、LH和FSH均参与卵泡发育与成熟。贺侠琴等[10]研究，PCOS患者血清LH水平高于对照组，LH可作为诊断PCOS的有效指标之一。刘侠等[11]研究发现，与对照组相比，PCOS患者血清LH水平显著升高，异常升高与胰岛素抵抗有关。子宫内膜容受性降低可能是PCOS患者不良妊娠结局的重要原因之一[12-13]。李杏英等[14]研究报道，PCOS患者经治疗后，PI、RI显著降低，Em明显升高，PI、RI及Em均可有效评估PCOS患者子宫内膜容受性。综上发现，研究血清mir-146a表达与血清性激素水平及子宫内膜容受性可能与PCOS的发生及妊娠结局有关。

本研究中，PCOS组血清mir-146a及LH、FSH水平均远高于对照组， E2水平低于对照组，提示血清mir-146a、LH及FSH水平升高及血清E2水平降低，可能在PCOS发生中起重要作用；PCOS组患者子宫内膜容受性指标PI、RI均高于对照组，Em低于对照组，与李杏英等[14]研究结果相似，提示PCOS患者发生了子宫内膜容受性异常变化。进一步分析PCOS患者妊娠结局显示，非妊娠组患者血清mir-146a、LH、FSH水平及PI、RI均高于妊娠组，血清E2水平及Em低于妊娠组，提示血清mir-146a及性激素水平异常可能与PCOS患者治疗后妊娠有关，子宫内膜容受性指标PI、RI、Em在PCOS患者妊娠中起重要作用。有研究发现IR与PCOS发病密切相关[15]。本研究对照组、妊娠组与非妊娠组BMI、空腹血糖、IR依次升高；与对照组相比，妊娠组孕周降低，早产儿、胎死宫内比例上升。推测由于mir-146a过量表达并参与胰岛素抵抗，造成患者机体雌激素水平异常变化，并共同导致子宫激素内环境的变化，引起子宫内膜容受性改变。虽然部分PCOS患者能够妊娠，但胚胎发育也可能受到影响，从而引起不良妊娠结局。多因素logistic回归分析，mir-146a、E2、LH、FSH、PI、RI及Em均是影响PCOS患者治疗后妊娠的独立危险因素，提示临床通过检测上述指标可能在一定程度上预测PCOS患者的妊娠情况。

综上所述，血清mir-146a表达水平升高、血清雌激素水平及子宫内膜容受性异常，可能与PCOS发病及治疗后妊娠情况有关，均为影响PCOS患者治疗后不能妊娠的独立危险因素。由于影响PCOS患者妊娠结局的因素较多，本研究结果可能有一定偏差，尚需深入研究予以验证。