亮丙瑞林反加不同剂量雌激素对大鼠子宫异位内膜生长的影响及相关机制研究

殷金凤 付 琼 宋 玲 胡 婷 熊万春

四川省成都市第二人民医院(610000)

子宫内膜异位症是一种雌激素相关性疾病,减缓病灶复发的重要环节在于减少内源性雌激素产生[1]。反添加疗法可有效减轻低雌激素症状,但该疗法的开始时间和用药方案并无统一标准[2]。本实验通过自体移植制备子宫内膜异位症大鼠模型,采取亮丙瑞林反添加不同剂量的雌激素治疗,通过观察给药前后病灶体积变化、病灶组织类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达及血清糖类抗原125(CA125)浓度变化,评价亮丙瑞林反添加不同剂量雌激素对大鼠子宫异位内膜生长的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型

75只SPF级健康SD雌性大鼠,8～9周龄,体重180～210 g,购自上海凯学生物科技有限公司。动物模型的建立：大鼠适应性喂养7 d后,皮下注射苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份有限公司)0.10 mg/kg,使之处在同一动情周期。禁食禁饮12 h后7%水合氯醛麻醉,于下腹正中、尿道口上端1 cm作一2～3 cm纵行切口,结扎子宫系膜血管,随后结扎需切除的子宫段两端,分离子宫内膜。在腹壁切口两侧作一隧道,放置分离的子宫内膜并紧贴肌层,切口缝合,术后每日肌内注射庆大霉素0.10 ml,共3 d,预防感染。

1.2 分组及给药方法

造模后4周将大鼠随机分为模型组、亮丙瑞林组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组各15只。模型组予以生理盐水3 ml灌胃；亮丙瑞林组皮下注射用醋酸亮丙瑞林微球(上海丽珠制药有限公司)1 mg/kg,给药第2周时予以生理盐水3 ml灌胃反添加,1次/d,共2周；给药第2周时,低、中、高剂量组开始每日予以戊酸雌二醇(浙江仙琚制药股份有限公司)25、50、100 g/kg灌胃,1次/d,共2周。反添加疗法的戊酸雌二醇用量为每日0.25～1.0 mg(体重按60 kg计)[3-5],对应大鼠的用药剂量为25～100 g/kg,故本实验中设定戊酸雌二醇的3个剂量分别为25、50、100 g/kg。

1.3 异位病灶检测

分别于给药前和给药后4周、8周,各组均取5只大鼠开腹探查,测量异位病灶体积,计算公式(mm3)=长×宽2×0.5。免疫组织化学法检测大鼠异位病灶组织,将病灶组织4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋,连续切片,经DAB显色(武汉博士德生物工程有限公司),复染、脱水、透明、封片,检测组织中StAR和TNF-α的分布和表达情况。结果判读标准：采用半定量分析法,根据着色程度和阳性细胞数占比评分,着色程度分为无着色(0分),淡黄色、轻微黄色(1分),棕黄色、深黄色(2分),黑褐色、棕褐色(3分)；阳性细胞数占比分为≤5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、76%～100%(4分)。两项评分相乘为最终结果。

1.4 血清CA125 检测

取大鼠眼眶内眦静脉丛血,4℃离心取上清液-80℃保存,酶联免疫吸附试验法测定血清CA125浓度,试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 子宫内膜异位症大鼠病灶组织观察

造模期间未出现大鼠死亡情况。肉眼观察可见大鼠异位病灶内存在透亮液体,病灶呈囊泡样,表面被覆丰富脂肪组织,移植物可见新生血管爬行生长,周围可见丰富的结缔组织；经苏木精-伊红染色可见异位病灶上皮细胞核下空泡,细胞呈柱状排列,间质层较薄,可见少量腺体。见图1(封二)。

2.2 各组大鼠给药前后病灶体积变化

各组大鼠给药前病灶体积比较无差异(t=0.32～1.01,P>0.05)；模型组给药4、8周后病灶体积大于给药前(t=7.97、11.28,均P<0.05)；亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药4、8周后病灶体积较给药前缩小(t=8.07～15.85,均P<0.05),且给药8周后病灶体积较给药后周4增大(t=5.03、8.18、10.84、19.63,均P<0.05)；亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4、8周后病灶体积小于模型组(t=10.32～23.95,均P<0.05),中、高剂量组给药8周后病灶体积大于亮丙瑞林组和低剂量组(t=8.75、17.06、10.21、12.84,均P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠给药前后病灶体积比较

2.3 各组大鼠给药前后病灶组织StAR 和TNF-α 表达比较

StAR和TNF-α蛋白阳性细胞呈褐色、棕黄色,二者均主要定位于子宫内膜异位症病灶内膜组织腺上皮细胞浆中,StAR少量分布于在位内膜,TNF-α少量分布于间质细胞浆。各组大鼠给药前腹壁异位病灶组织StAR和TNF-α表达水平无差异(t=0.12～1.03,均P>0.05)；模型组给药后4周StAR表达与给药前无差异(P>0.05),8周时低于给药前(P<0.05),给药前后TNF-α表达无差异(均P>0.05)；相比给药前,亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4周StAR和TNF-α表达量均下降,中、高剂量组给药后8周TNF-α表达量高于给药后4周(均P<0.05)；亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4周StAR和TNF-α表达无差异(均P>0.05)；相比模型组,亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4周StAR和TNF-α表达量均下降,中、高剂量组给药后8周StAR和TNF-α表达量较亮丙瑞林组和低剂量组升高(均P<0.05)。见图2(封二)和表2。

表2 各组大鼠给药前后病灶组织StAR 、TNF-α 表达比较

(接下表)

2.4 各组大鼠给药前后血清CA125 浓度比较

血清CA125浓度,各组大鼠给药前比较无差异(P>0.05)；相比模型组,亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4、8周浓度均下降,中、高剂量组给药后8周浓度较给药后4周升高(P<0.05),且高于亮丙瑞林组和低剂量组(均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠给药前后血清CA125 浓度比较

3 讨论

促性腺激素释放激素受体激动剂可快速降低血清雌二醇含量,临床广泛用于子宫内膜异位症治疗[6],但长期使用可能会引起低雌激素血症,出现不可逆的骨丢失等,临床应用受限[7-9]。长时间低雌激素血症可导致原始卵泡减少、卵泡闭锁,使卵巢功能下降[10-11]。近年来提出反添加疗法,即联合应用促性腺激素释放激素受体激动剂和类固醇激素[12],如何控制用药时间和用量仍是目前亟需解决的问题,并且脉冲式加用性激素是否会影响隐伏的雌激素敏感组织,使疾病提前复发的问题亦值得研究。

本研究中,相比模型组,亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后4、8周病灶体积和血清CA125浓度均明显下降,表明亮丙瑞林可有效治疗大鼠子宫内膜异位症,疗效肯定。且亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后8周病灶体积较给药后4周增大,中、高剂量组体积增加的更大。结果说明,停药后可能会出现子宫异位内膜生长的倾向,而反添加给予中、高剂量雌激素(50、100 g/kg)后病灶体积明显大于低剂量雌激素(25 g/kg)组和单一应用亮丙瑞林组,同时中、高剂量组给药后8周血清CA125浓度较给药后4周均显著升高,说明反添加给予中、高剂量雌激素可能会加速子宫异位内膜的生长。

TNF-α是由激活的巨噬细胞、淋巴细胞及单核细胞等产生的一种细胞因子[13]。在生理状态下可参与并调节抗肿瘤、免疫监视、胚胎着床及卵泡发育等重要生物学过程；病理状态下具有介导免疫和炎症反应作用[14-15]。在子宫内膜异位症发生发展过程中,TNF-α参与并调节新生血管生成、炎症浸润及粘连形成等。TNF-α既可促进多种炎症细胞因子的释放,亦可诱导间质细胞及间皮间黏附,促进子宫内膜间质细胞产生,在子宫内膜异位症病理过程中起重要作用[16-17]。本研究中,给药前TNF-α高表达于大鼠子宫内膜异位症病灶组织,说明高表达的TNF-α可能诱导了病情的发生发展；亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药后周4TNF-α表达量均下降,说明亮丙瑞林反添加雌激素对子宫内膜异位症大鼠的治疗效果；中、高剂量组给药后周8TNF-α表达量较亮丙瑞林组和低剂量组均升高,表明中、高剂量雌激素可能通过增强TNF-α的表达而促进了子宫异位内膜的生长。

作为类固醇激素产生的一种主要限速酶,StAR可使胆固醇从线粒体的外膜转至内膜,可在芳香化酶和P450scc等其它类固醇激素合成酶作用下对雌二醇进行合成[18-19]。本研究显示,给药前StAR高表达于大鼠子宫内膜异位症病灶组织,推测StAR可能参与了子宫内膜异位症的病理过程；而亮丙瑞林组和低、中、高剂量组给药4周后StAR表达量均下降,中、高剂量组给药8周后StAR表达量较亮丙瑞林组和低剂量组升高。表明中、高剂量雌激素可能通过促进StAR的高表达而诱导大鼠子宫异位内膜生长。

综上所述,亮丙瑞林反添加低剂量雌激素(25 g/kg)对子宫内膜异位症大鼠治疗可能有更佳效果,而添加中、高剂量雌激素(50g/kg、100 g/kg)可能会促进异位内膜生长,其机制可能与提高了StAR、TNF-α表达及CA125浓度密切相关。但本实验样本量较少,且观察时间较短,尚需大样本、长时间的研究和临床应用的循证医学证据。