红枣发酵饮料的研制及电子感官技术在其货架期评定中的应用

王鑫，李雅丽，马芙俊，吴逸民，段盛林，王维岗，李兵

1(河北工程大学，河北 邯郸，056038) 2(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015) 3(功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室，北京，100015) 4(清涧北国枣业有限责任公司，陕西 榆林，718300)

红枣又名华枣，是我国北方栽培发展的热点果品之一[1]，具有“养阴安神、补中益气、通九窍、润心肺、治虚损”等功效[2]。红枣口感甘甜、富含Vc等多种营养物质，其中干枣总糖含量高达53%～72%[3]，是乳酸菌发酵的优良底物[4]。

目前，关于红枣乳酸菌发酵饮料报道较少，且研究主要集中在红枣功能性成分检测和医学上的应用探讨[5-7]。红枣乳酸菌发酵饮料的关键是乳酸菌利用红枣的营养成分进行大量繁殖，且在产品货架期内维持发酵菌种的较高存活率[7-9]。韩雪[10]通过研究5种乳酸菌分别对陕西狗头枣枣浆发酵后的游离态酚酸含量、组成和总抗氧化活性的变化，得出植物乳杆菌能够促进游离态酚酸的释放，有效提高枣浆生物利用率的结论。张丽华等[11]研究得出灰枣红枣汁经过植物乳杆菌发酵后具有一定的抗氧化和自由基清除活性的能力。本研究通过3种不同乳酸菌复合发酵技术制备一款红枣发酵饮料，测定其活性物质环磷酸腺苷含量，并利用电子鼻、电子舌、色差仪电子感官技术评定其货架期质量，为其市场流通奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清涧红枣，市售；干酪乳杆菌(活菌数≥1.0×1011CFU/mL)、植物乳杆菌(活菌数3.0×1011CFU/mL)、鼠李糖乳杆菌(活菌数≥3.0×1011CFU/mL)，江苏微康生物科技有限公司；NaHCO3，天津红依食品有限公司；果胶酶(酶活力10 000 U/g)、纤维素酶(酶活力20 000 U/g),北京卫诺恩生物技术有限公司； MRS琼脂培养基,北京奥博星生物技术有限公司；(NH4)2HPO4江苏克伦多食品配料有限公司；环磷酸腺苷标准品(纯度≥98%),北京索莱宝科技有限公司；甲醇(色谱纯)，北京迈瑞达科技有限公司；KH2PO4(色谱纯)，上海安普实验科技股份有限公司。

ISO9001型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；FE20型pH值计，梅特勒仪器上海有限公司；PAL-1 型数显手持式折光糖度仪，日本 ATAGO；LD4-40型低速离心机，北京京立离心机有限公司；HC-3618R型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DL-CJ2NDI型超净工作台，北京松联哈尔仪器制造有限公司；SPX-150B型生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；LC-6AD型高效液相色谱仪，岛津(香港)有限公司；VORTEX-5型旋涡混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TS-5000Z型电子舌，日本Insent公司；Fox4000型电子鼻，法国Alpha M.O.S；SE-6000型分光色差计，日本电色公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红枣发酵饮料的制备

清涧红枣(干枣)→拣选、清洗→预煮(95 ℃、10 min)→去核→加水打浆→pH调至4.5→酶解(50 ℃、1 h)→灭酶(95 ℃、10 min)→冷却、离心分离(3 000 r/min、5 min)→枣原清汁pH值调节4.5→杀菌(95 ℃、10 min)→冷却(37 ℃)制得清汁备用

挑选水分约22%～25%、无腐烂变质、无病虫害的干枣，清洗；红枣与水按1∶2.5的比例置于95 ℃，水浴10 min。将预煮后的枣去核，加入预煮水进行打浆，定容红枣与水料液比1∶4。调节pH至4.5，分别添加1.25 g/L果胶酶和纤维素酶，50 ℃酶解1 h。升温至95 ℃，灭酶5 min。经3 000 r/min，5 min离心后，收集上清液。调节pH至4.5，95 ℃灭菌10 min，制得清汁备用(枣清汁初始可溶性固形物含量为15.5%)。

在无菌条件下，向灭菌后的枣清汁接种一定量的供试菌种，置于37℃培养箱恒温发酵。

1.2.2 菌种发酵时间的确定

分别研究干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，接菌量均为0.01%，发酵时间(0、12、24、48、72、96 h)，发酵温度37 ℃；考察其对红枣乳酸菌饮料品质的影响，以感官评价为评价指标，确定最适发酵时间。

1.2.3 红枣发酵饮料工艺优化

1.2.3.1 单因素试验

结合前期试验，分别研究初始可溶性固形物含量(12.5%、13.5%、14.5%、15.5%)，接菌量均为0.01%(m/m)，于37 ℃发酵48 h过程中对红枣发酵饮料pH的影响；接种干酪乳杆菌(0.005%、0.007 5%、0.01%)、植物乳杆菌(0.001 25%、0.002 5%、0.005%)、鼠李糖乳杆菌(0.001 25%、0.002 5%、0.005%)，初始可溶性固形物含量13.5%，发酵48 h过程中对红枣发酵饮料pH的影响。

1.2.3.2 正交试验

在上述试验结果的基础上，以发酵时间、枣清汁初始可溶性固形物含量、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种为考察因素，发酵时间取4个水平，初始可溶性固形物含量及3个菌种添加量各取2个水平，以pH值、感官评定为考察指标设计L8(41×24)正交试验(表1)，确定红枣发酵饮料的最佳发酵工艺条件。

表1 发酵工艺因素水平表

1.3 HPLC法测定环磷酸腺苷含量

通过对比枣清汁和发酵后环磷酸腺苷含量的变化，对比乳酸菌发酵对环磷酸腺苷含量的影响。

1.3.1 环磷酸腺苷含量分析方法[12-14]

使用仪器：LC-6AD高效液相色谱仪；色谱柱：XTERRA®MS C18(4.6 mm×250mm，5 μm)；流动相：色谱纯甲醇∶0.05 mol/L色谱纯KH2PO4(20∶80)；流速：0.5 mL/min；检测波长为：254 nm；柱温：40 ℃，进样量为10 μL。

1.3.2 标准系列溶液的配制

用超纯水溶解配制100 μg/mL的环磷酸腺苷标准溶液，再稀释配制成1、3、5、10、15 μg/mL标准系列溶液，取各浓度标准溶液过0.22 μm有机滤膜，待测，均临用新配。

1.3.3 样品前处理

分别准确吸取1 mL枣清汁和发酵枣汁于10 mL容量瓶，用超纯水定容，摇匀移至15 mL离心管，旋涡振荡混匀，经高速离心后过0.22 μm微孔滤膜进样，分析测定环磷酸腺苷峰面积色谱图，并计算出枣清汁与发酵枣汁中环磷酸腺苷含量。

1.4 货架期评定

按1.2.3.2较优发酵条件制备出乳酸菌发酵饮料，在4 ℃条件下贮藏28 d，结合感官评定、微生物指标、理化指标及电子感官技术对红枣发酵饮料贮藏期内品质进行评定并以此判定产品货架期。

1.4.1 人体感官评定

邀请10名感官评定者参照表1的感官评定标准，分别从色泽、口感、香气、和澄清度为评分项目，按评分要求在给定的分数内逐项打分后，满分为100分，四舍五入，以整数标度，取其平均值作为评分结果[12]。

表2 发酵红枣汁的感官评定标准

1.4.2 微生物及理化指标的测定

乳酸菌活菌数：按照GB4789.35—2016规定执行[16]；总酸按照GB12456—2008规定执行，采用酸碱滴定法[17]；还原糖按照GB5009.7—2016规定执行，采用的直接滴定法[18]。

1.4.3 电子感官技术评定

1.4.3.1 电子鼻感官评定

利用电子鼻MOS 传感器对红枣乳酸菌发酵饮料香气的不同响应值进行分析，通过电子鼻AlpHa Soft 12.45 版软件对红枣乳酸菌发酵饮料的检测数据进行分析。

取1 mL样品，注入到20 mL上样顶空瓶中，密封封口，放置室温10 min，待挥发性物质达到平衡状态后，采用顶空上样法对样品进行检测。检测参数设置：采集时间120 s，洁净空气流速150 mL/min，进样量4 mL，注射速度1 000 μL/s；自动进样仪器参数条件设置：孵化时间120 s，孵化温度50 ℃[19,21-22]。

1.4.3.2 电子舌感官评定

将电子舌传感器经过活化、自检、校准和诊断后，取样品25 g于电子舌专用样品杯中，室温下放置。检测序列采用清洗溶液和待测样品交替进行滋味检测。测定方法：电极清洗90 s→缓冲液清洗120 s→缓冲液清洗120 s→稳定化30 s→测试样品30 s→缓冲液清洗3 s→缓冲液清洗3 s→回味测定30 s。循环测定4次，采用电子舌自带软件取稳定状态下的信号进行分析[15,20,24]。

1.4.3.3 色差仪对颜色的评定

在贮藏0、7、14、21、28 d时，称取20 g待测样品于色差仪样品池内，测定其明亮度L*、红绿色调a*、蓝黄色调b*3个方面进行评定。

1.5 数据处理

试验样品均重复3次，结果以(平均值±标准差)的形式表示。采用Microsoft Excel和Origin 8.6软件处理实验数据并进行统计分析、作图，差异显著性分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌种发酵时间的确定

由图1可知，随着发酵时间延长，3种不同菌种发酵饮料的pH均呈现先快后慢的下降趋势，总酸呈现出缓慢升高趋势。植物乳杆菌在发酵前24 h，pH值低于其他2菌种，总酸含量对应高于其他2种菌种。分析原因可能是植物乳杆菌能高效利用枣汁中的碳源产酸，较于其他2种乳酸菌的产酸量高。但发酵至48 h，3个菌种发酵饮料的pH和总酸均无显著差异(P>0.05)。在48 h至96 h，3个菌种发酵饮料pH下降速度明显降低。结合感官评定、pH和总酸含量，综合确定发酵终止时间为48 h。

图1 发酵时间对发酵饮料pH和总酸的影响

对3种不同菌种发酵48h发酵饮料进行感官评定，结果见表3。

表3 乳酸菌发酵饮料感官评定结果

结果表明，干酪乳杆菌发酵饮料无论从色泽、口感、香气、澄清度得分都很高。植物乳杆菌发酵饮料在口感、香气、澄清度方面得分较高，但颜色欠佳，试验中发现植物乳杆菌样品颜色暗红，分析原因可能是植物乳杆菌在37 ℃、48 h培养发酵过程中使红枣中营养成分产生了非酶褐变[25]。鼠李糖乳杆菌发酵饮料在色泽、口感、香气方面得分均较高，但样品澄清度欠佳。综合分析，干酪乳杆菌宜作为主要发酵菌种，同时复配小比例植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌，在保持产品较佳色泽及澄清度前提下使整体风味更加丰富饱满。

2.2 红枣发酵饮料工艺优化结果

2.2.1 枣清汁初始可溶性固形物含量对乳酸菌发酵汁pH值影响

由图2可知，随着枣清汁初始可溶性固形物含量提高，干酪乳杆菌发酵饮料pH变化不显著(P>0.05)，但植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌发酵饮料pH值呈现先降低后升高的趋势。说明初始可溶性固形物含量过低或过高均不利于2个菌种进行发酵。初步筛选初始可溶性固形物含量13.5%和14.5%。

图2 初始可溶性固形物含量对发酵饮料pH影响

2.2.2 发酵菌种及添加量对乳酸菌发酵饮料pH值影响

由图3 可知，经过48 h发酵，3菌种发酵饮料pH均随菌种添加量增加而降低。

图3 发酵菌种及添加量对发酵饮料pH值影响

干酪乳杆菌菌种添加量为0.005%、0.007 5%、0.01%时,经过48 h发酵，发酵饮料pH值分别为4.05、3.82、3.65，即干酪乳杆菌发酵饮料pH值随菌种添加量增加而显著降低(P<0.05)。而干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵饮料pH随着菌种添加量增加未显著变化(P>0.05)，即植物乳杆菌与鼠李糖乳杆菌在添加量分别为0.001 25%、0.002 5%、0.005%时,经过48 h发酵，发酵饮料pH值差异不显著(P>0.05)。因此，选定干酪乳杆菌添加量0.007 5%和0.01%、植物乳杆菌添加量0.002 5%和0.001 25%、鼠李糖乳杆菌添加量0.002 5%和0.001 25%作为正交实验考察因素。

2.2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上进行L8(41×24)正交试验，以pH及感官评分为指标，结果如表4所示。

通过R值计算，以pH值为考察指标时，RA>RB>RD>RE>RC，即发酵时间>初始可溶性固形物>植物乳杆菌>鼠李糖乳杆菌>干酪乳杆菌。结合2.1结果，干酪乳酸菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵48 h时，pH值分别为3.61、3.56、3.55，此时产品感官得分较高。pH过高说明发酵速度太慢，pH过低口感会变差。因此选定pH在3.55～3.61范围内的组合为宜，即A2B1C1D2E2和A2B2C2D1E1。

以感官评定得分为指标时，RA>RC>RD=RE>RB，即发酵时间>干酪乳杆菌>植物乳杆菌=鼠李糖乳杆菌>初始可溶性固形物含量，得出最佳工艺方案是A2B1C1D2E2，此时感官得分最高。因此最终选择工艺方案为A2B1C1D2E2进行发酵。

表4 正交实验结果及极差分析

注：发酵温度37 ℃，发酵时间48 h，初始pH值为4.5

2.3 HPLC测定环磷酸腺苷含量结果

环磷酸腺苷是枣中最具代表性的功能性成分，发酵过程中环磷酸腺苷含量无显著变化，枣清汁发酵前含量为25.3 μg/mL，发酵后含量为21.4 μg/mL。说明本工艺较好保留了枣清汁的环磷酸腺苷。

2.4 货架期评定结果

2.4.1 人体感官评定结果

由图4可知，随着贮藏时间的增加，感官品质评分在贮藏21 d内接受度较好，无显著变化(P>0.05)，在贮藏第28天时，感官评分显著降低(P<0.05)，因此，依据感官评定结果，初步预测货架期为21 d。

图4 货架期感官评定

2.4.2 微生物及理化指标的测定结果

由表5可知，随着贮藏时间的增加，pH、可溶性固形物含量及还原糖含量在28 d内趋于稳定，发酵液的总酸含量在贮藏第21天呈现升高，说明乳酸菌在货架期间未停止发酵。

表5 贮藏过程中质量指标的变化

注：同行数据间肩标有*表示差异显著(P<0.05)，无*表示差异不显著(P>0.05)

结合图4 感官评定结果，贮藏21 d内，感官品质及接受度较好，且微生物及理化指标符合国家轻工业局推荐性行业标准(QB/T5356—2018果蔬发酵汁)，因此，进一步判定红枣发酵饮料的货架期为21 d。

2.4.3 电子感官技术评定结果

2.4.3.1 电子鼻的测定结果

图5是红枣乳酸菌发酵饮料香气成分检测中18根传感器响应值的变化图，图中曲线各代表1种传感器，从图5可知，各传感器响应值在初始15 s内快速变化(上升或下降)趋势，到40 s后响应值强度逐渐趋于平缓。T、P型传感器响应值大部分在0.6～0.8 之间，能够将样品的差异性明显表现出来。

图5 传感器响应图

根据图6中传感器响应值绘制成的气味指纹图谱测定结果显示，PA/2(乙醇、氨水、胺类化合物)、P30/1(碳氢化合物燃烧产物)和P30/2(乙醇、燃烧产物)对红枣乳酸菌发酵饮料香气响应显著，随着货架期的延长，T、P型传感器响应值趋于平稳，无明显差异。说明此贮藏条件可以让红枣乳酸菌发酵饮料中的香气得到很好保留。

由图7主成分分析 PCA1 和 PCA2 2个主轴分析结果上看，PCA第1主成分的贡献率为63.42%，PCA第2主成分的贡献率为 19.28%，总累积贡献率为85%，说明这2组主成分包含了样品中的绝大部分香气的信息，且主要是PCA 第1主成分对红枣发酵饮料货架期气味的区分作用。未发酵的红枣原清汁与发酵后贮藏0～21 d内的样品在主成分坐标的各区域分布较远，说明样品间气味区别明显。在贮藏28 d时，主成分坐标的不同区域界限清晰，分离较远，说明产品经过28 d贮藏后气味发生了较大变化。此结果与感官评定及微生物、理化指标测定结果相互印证，因此，电子鼻可用于判定红枣发酵饮料的货架期。

图6 货架期气味指纹图谱

图7 气味的PCA分析图

2.4.3.2 电子舌的测定结果

根据图8可知，枣汁发酵后酸味显著增加，鲜味显著降低，其他口感变化相对不明显。推测原因是乳酸菌在发酵过程中消耗了糖类物质产生大量乳酸所导致。此外，推测乳酸菌在发酵过程中消耗了红枣中部分无机盐，使其鲜味明显降低。其次，在21 d贮藏时间内，味觉各项指标未发生显著变化；在贮藏至28 d时，红枣发酵饮料酸味显著增加，与感官评定结果基本一致。因此，电子舌可用于评定发酵红枣饮料货架期[13]。

图8 货架期味觉的指纹图谱

2.4.3.3 色差仪对颜色的测定结果

贮藏过程中颜色变化如图9所示，在28 d贮藏期内，红枣发酵饮料的L*值、a*值、b*值无显著变化(P>0.05)，说明此贮藏条件下，红枣发酵饮料的颜色稳定性较好。

图9 贮藏过程中颜色的变化

3 结果与讨论

本研究以清涧红枣为主要原料，制备红枣枣清汁，进行干酪乳酸菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌3种菌种复配发酵，通过发酵时间、初始可溶性固形物含量和菌种添加量单因素试验和正交试验，确定按干酪乳杆菌∶植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌=6∶1∶1的比例复配发酵，接菌量为0.01%(m/m)，37 ℃发酵48 h为宜。在此条件下产品风味独特、营养丰富、乳酸菌含量高，为市场活菌型饮料产品提供了理论基础。

结合感官评定、微生物指标、理化指标电子感官技术对货架期内品质进行评定。结果表明，在21 d内其感官评分较高，接受度较好，符合标准(QB/T5356—2018果蔬发酵汁)。