基于Cell-SELEX的核酸适配体在肿瘤诊治中的应用

田彩平 廖世奇 孙敬阳 王维君 许金苓 杨碎胜

恶性肿瘤已经成为世界性的健康问题之一，据世界卫生组织报道，到2025年恶性肿瘤病例将从2012年的1 400 万增加到2 000 多万［1］。恶性肿瘤的发生、侵袭和转移有很多的诱导因素，比如病毒感染、环境因素和基因异常等等，这些因素导致恶性肿瘤的复杂性［2］。恶性肿瘤与基因组之间有着密切的联系，特异性表型与个体基因型的相关性是肿瘤（肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤）研究的关键，恶性肿瘤发生的过程主要是由原癌基因的损伤或突变引起的，这些基因编码了与细胞增殖、分化有关的蛋白质，以及与生长和凋亡有关的信号［3］。蛋白质是关于细胞内发生变化的更准确的信息来源，是疾病本身发展的一个关键指标，它可以在体液或组织中被检测到，所以蛋白质可以成为疾病检测的生物标记。恶性肿瘤细胞和正常细胞表面有不同的受体蛋白，利用这些受体可以判断疾病进展以及预后。Tuerk 等［4］构建了指数富集的配基系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术，在此基础上，Tan 等［5］构建了Cell-SELEX 技术，它是以整个细胞作为靶标筛选特异性核酸适配体的技术，并且不需要预先了解细胞表面蛋白种类及其表达水平，特别适用于肿瘤细胞的核酸适配体筛选，为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来了新的思路和方法，在肿瘤诊治领域具有广泛的应用前景。本文对基于Cell-SELEX的核酸适配体在肿瘤诊治中的应用做一综述，以期为Cell-SELEX 的研究提供参考依据，对恶性肿瘤的分子诊断、个体化治疗研究提供帮助。

1 SELEX 技术

SELEX 技术是一种新的组合化学技术，该技术应用体外化学合成的大容量随机寡核苷酸文库（ss-DNA 文库和RNA 文库）与靶物质结合，洗掉未与靶物质结合的DNA，分离与靶物质结合的DNA，以此DNA 为模板进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增，进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA 或RNA分子被洗去，而与靶物质有高亲和力的DNA 或RNA 从随机文库中分离出来，即核酸适配体［6］。

人工合成的单链随机寡核苷酸文库包括DNA文库、RNA 文库、修饰化的RNA 文库，该文库是两端约为20 个碱基的固定序列（该区域带有限制性内切酶位点，是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点），中间为约20～40 个碱基的随机序列，库容量可达1015，理论上，库容量达到1014以上的随机寡核苷酸文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，可为自然界存在的所有分子“配型”，识别特异性的核酸配体［7］。单链寡核苷酸因序列不同，可形成构象不同且热力学上稳定的二级和三级结构，如发卡、口袋、假结、G 四聚体等，由于随机序列的存在，文库中的单链寡核苷酸因序列各异而形成多样而独特的空间构象，适配体能够通过碱基配对、范德华力，氢键和静电等相互作用和靶标结合，主要是特异性茎环识别靶标［8］（见图1A 至C），然后结合PCR 体外扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得高亲和力、高特异性的核酸适配体［9］。

应用SELEX 技术筛选的靶物质范围广泛，包括DNA聚合酶、人免疫缺陷病毒反转录酶（human immunodeficiency virus reverse transcriptase 1，HIV-1）、细胞生长因子、激素、小肽、抗体以及三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）、氨基酸等小分子有机物，甚至金属离子、糖、有机染料，以及完整的细胞、病毒、孢子等［10］。该技术和抗体相比具有操作简便，筛选周期短等优点，更为重要的是它与靶细胞或靶分子的高特异性和高亲和性［11］（见表1）。经过多年的研究，SELEX技术筛选的适配体在疾病诊断、治疗、药物递送、生物成像、分析试剂、法医鉴定、危险性检测、食品应用、搜索工具等多个方面得到应用［12］。

2 Cell-SELEX 技术

尽管应用传统SELEX 技术已经筛选到许多高特异性的适配体，但生物体内在生理条件下可能发生翻译后修饰或三维构象的改变，使得筛选到的适配体无法识别该靶标在细胞膜表面的天然构象。细胞作为与外界环境交换物质和能量的结构，细胞表面膜上存在大量的蛋白质类功能分子，占细胞蛋白总量的30%，这些蛋白质类功能分子能够维持细胞结构的完整性，并且对细胞生理功能起着关键作用［13］。如离子通道与胞膜的物质转运功能有关，受体与细胞辨认和接受环境中特异的化学性刺激有关，白细胞分化抗原（Cluster of Differentiation，CD）分子与细胞的免疫功能有关［14］。因此，为了筛选出能够识别膜蛋白天然构象的适配体，Tan 等［5］率先提出了Cell-SELEX 技术，与传统SELEX 技术不同的是，Cell-SELEX 的靶标是完整的活细胞，筛选出细胞表面分子的适配体，该技术最大的优点是在筛选过程中能够同时以多种呈天然构象的膜蛋白为靶标分子，并且不需要预先了解细胞表面蛋白种类及其表达水平。恶性肿瘤的发生是由于基因的突变，这些突变的基因会引起细胞内部分子的改变，最终引起细胞形态和生理的改变。研究表明膜蛋白的种类及其表达水平均与恶性肿瘤的发生发展密切相关，因而Cell-SELEX 技术对恶性肿瘤发生发展分子机制的研究、恶性肿瘤新标志物的发现以及恶性肿瘤精准诊疗新方法的提出具有一定的促进作用，在恶性肿瘤的检测诊疗及生物标志物的研究方面具有良好的前景。

图1 适配体的结构和与它特异性结合的靶标示意图Figure 1 Depiction of the aptamer structure and its interaction with the target

表1 核酸适配体和蛋白质抗体特性对比Table 1 The characteristics comparison of nucleic acid aptamers and protein antibody

Cell-SELEX 筛选过程主要包括孵育、洗脱和扩增3 个过程。为了提高所筛选的核酸适配体的特异性，文库先与形态上、生物学上以及生物化学上相似的反筛靶细胞（一般以正常细胞作为反筛靶细胞）结合，然后再与正筛靶细胞（一般以肿瘤细胞作为正筛靶细胞）结合，然后洗脱掉没有与靶蛋白结合的核酸分子，具有强结合力的核酸适配体通过PCR 技术扩增分离得到，然后被用作下一轮筛选的次级文库，这个过程重复几个循环，直到筛选到高亲和力和高特异性的适配体为止，最后，通过克隆测序，测定筛选得到的适配体分子的详细序列信息。

3 筛选的核酸适配体在肿瘤诊治中的应用

应用Cell-SELEX 技术筛选到了许多针对细菌细胞、大肠杆菌、被狂犬病病毒感染的幼鼠细胞系（BHK-21）的核酸适配体，更重要的是筛选到很多针对不同恶性肿瘤细胞类型的核酸适配体，比如针对肺癌、恶性胶质瘤、胰腺、结肠直肠癌、肝癌、淋巴瘤、白血病以及其它恶性肿瘤的核酸适配体。这些适配体的成功筛选对恶性肿瘤生物靶标的发现、诊断、治疗、分子成像、药物递送都已有应用［15-16］。如从恶性胶质瘤K308 细胞筛选的WQY-9-B 适配体用于诊断分子探针，从卵巢癌Caov-3 细胞筛选的RLA01、RLA02 和RLA03 适配体用于诊断和药物递送，从乳腺癌MCF-7细胞筛选的MS03适配体用于诊断和治疗，从胰腺导管腺癌PL45 细胞系筛选的XQ-2d 适配体用于体内成像和临床组织识别（见表2）。

表2 应用Cell-SELEX 筛选出的核酸适配体Table 2 The nucleic acid aptamers screened by cell-SELEX

3.1 在肿瘤标志物发现方面的应用

通过Cell-SELEX 筛选的核酸适体可以特异性识别肿瘤细胞，其识别的基础是肿瘤细胞与正常细胞之间存在的未知膜蛋白的分子差异。因此，分离鉴定能够与肿瘤细胞特异性识别的核酸适配体结合的靶蛋白就可以发现肿瘤标志物。Shangguan 等［33］利用Cell-SELEX 技术成功的发现了对于T 细胞急性淋巴白血病的潜在肿瘤标志物酪氨酸蛋白激酶受体分子（protein tyrosine kinase 7，PTK7）。Jia 等［24］利用该技术发现CD109 有可能成为对鼻咽癌进行早期诊断和治疗的一个新的肿瘤标志物。Kaur 等［34］用该技术筛选出的能够抑制肿瘤细胞侵袭的核酸适体TOV6，通过siRNA（小干扰RNA）沉默等技术，确定出了卵巢癌的潜在肿瘤标志物磷酸化应激诱导蛋白（stress-induced phosphoprotein 1，STIP1）等。

3.2 在肿瘤靶向治疗方面的应用

药物对肿瘤治疗效果不理想的原因大多数是药物对肿瘤细胞的选择性差、毒性大以及易产生耐药性等，由于核酸适体对靶细胞有高亲和性和特异性，所以在肿瘤的靶向治疗中具有重要意义。Meng 等［35］将抗癌药物DOX 与人肝肿瘤细胞株LH86 的核酸适配体TLS11a-GC 偶连形成药物-适配体共轭探针，实验结果表明DOX-TLS11a-GC对靶细胞具有靶向性与特异性，因此该核酸适配体可以用于抗癌药物的靶向递送。Liu 等［36］将抗癌药物DOX 包裹于纳米颗粒中，再与适配体结合组装成三维纳米结构，结果证明DOX 能有效稳定地插入到适配体中，这样改装的DOX 对人乳腺癌细胞的耐药性具有抑制作用。Zhu 等［37］研究发现用核酸适配体作为火车头识别靶细胞，由DNA 组装的车厢用来载药，以此达到靶向治疗的目的。此外，适配体结合其他材料应用于肿瘤靶向治疗的研究还有很多，相信其可以作为药物载体在肿瘤诊治中发挥重要作用。

3.3 在循环肿瘤细胞检测方面的应用

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）能够实时反应肿瘤动态，对肿瘤的侵袭转移监测以及预后评估都有重要价值，但由于其在癌症患者外周血液中含量少，很难被检测到。由于Cell-SELEX 筛选出的核酸适体具有优越的细胞特异性和亲和性，结合微流控技术，为CTCs 的检测提供了新的方法。方晓红等［38］利用Cell-SELEX 筛选到了与非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）特异性结合的核酸适体，然后对其进行修饰使之与硅纳米微流芯片结合，检测到晚期肺小细胞肺癌患者外周血中的CTCs。Xu 等［39］设计了一种能够高效、高选择性并简便的捕获CTCs 的微流体系统。当细胞混合物通过该微流体系统时，能够捕获不同类型的白血病细胞。方帅［40］采用上转换发光材料UCNP 和sgc8 结合来检测CTCs 中人急性淋巴白血病细胞（human acute lymphatic leukemia cells，CCRF-CEM），并将检测得到的CTCs 细胞利用超顺磁磁性纳米材料进行有效的分离，此外，他们还模拟了临床样本，即使靶细胞数量极少时，其检测模型也能够进行高效率的捕获、富集和分离。

3.4 作为药物方面的应用

核酸适配体可以直接作为药物来治疗肿瘤，其原理是作为药物分子结合肿瘤细胞中的相关代谢分子来影响细胞调节途径，例如阻遏信号传导、血管生成以及免疫功能等，从而进行细胞杀伤或调控凋亡，阻止肿瘤细胞侵袭转移。由Eyetech 与辉瑞公司联合生产的核酸适配体药物Macugen［41］作为一种抗血管内皮生长因子的RNA 适配体，能有效治疗年龄相关性黄斑病变，也在2004年被美国食品和药物管理局批准上市，Macugen 的上市为适配体药物研究带来了曙光。Lee 等［42］研究发现骨膜蛋白的适配体PNDA-3 能破坏骨膜蛋白与其细胞表面受体的相互作用，从而抑制骨膜蛋白诱导的乳腺癌细胞的黏附与转移，可用于抑制乳腺癌的扩增与转移的潜在药物。目前有数百种的核酸适配体药物进行临床验证，相信随着技术的发展，核酸适配体药物将会展现出广阔的应用前景。

4 展望

由于核酸适配体具有分子量小、设计灵活、易于修饰等优点，在临床诊断和疾病治疗中表现出良好的发展前景，Cell-SELEX 与靶细胞膜蛋白高特异性、高亲和性的结合，能较好地区分不同细胞之间的膜蛋白差异，是用于恶性肿瘤检测的理想工具。应用Cell-SELEX 技术筛选的适配体在恶性胶质瘤、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等恶性肿瘤的诊断治疗中已有应用，但是核酸适配体广泛应用于临床还需克服一定的困难。首先，Cell-SELEX 适配体筛选结果与核苷酸适配体的类型、长度、碱基组成和修饰有关系，还与靶标蛋白的离子强度、缓冲试剂成分、温度、pH 值等也有关系，此外还与洗脱时间、洗脱次数、文库纯度、文库浓度与靶蛋白的比率等都有关系，因此限制了在和临床与药物开发等方面的应用。尽管存在制约因素，但是相信随着研究的不断深入，这些难题将会被攻克，Cell-SELEX 技术筛选的核酸适配体在肿瘤的临床诊治中将有可能得到广泛应用。