抗苗勒管激素的单克隆抗体制备与鉴定

苏晓菱 李丽蓥 李苗苗 何洁 王瑞雪 王勇.2★ 罗树红★

抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）作为女性卵巢储备功能的评价以及辅助生殖技术中卵巢反应性评估的激素，是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌。与其他临床常用卵巢功能的生物学指标相比AMH 浓度相对稳定［1］。随着国内“二孩”政策的开放，评估高龄女性卵巢储备功能成为了辅助生殖技术中至关重要的一环［2］。研究表明抗苗勒管激素是评价卵巢储备功能的稳定指标，不受月经周期、口服避孕药、促性腺激素释放激素的影响，是评价卵巢储备功能最直接、准确的指标。血清AMH 的水平与年龄呈负相关。其水平低于相应年龄段正常参考范围，则可认为卵巢早衰。高水平的AMH 为多囊卵巢综合症的诊断提供依据［3-5］。将纯化后的原核表达的AMH 蛋白作为抗原免疫小鼠。将抗AMH 蛋白单克隆抗体应用到评估卵巢储备能力的诊断中。现今已发展到全自动AMH 检测技术［6-7］，简化了繁琐的操作步骤。本抗体对有望替代进口AMH 抗体，降低AMH 诊断试盒的成本。

1 材料与方法

1.1 实验材料

AMH 重组蛋白由本实验室制备；BALB/c 小鼠购自南方医科大学实验动物中心；SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞由本实验室保存并培养。

1.2 试剂

HAT/ HT 选择性培养基及添加剂、福氏佐剂、细胞融合剂PEG1450 均购自美国Sigma 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 购自上海生工生物工程；胎牛血清、DMEM 培养基均购自中国GIBCO 公司；Protein G 亲和层析柱和NI-NTA 亲和层析柱购自GE 医疗中国；BCA（Bicinchoninic acid, BCA )蛋白定量检测试剂盒购自中国碧云天生物技术公司（Beyotime Biotechnology）。

1.3 AMH 蛋白的制备与纯化

选取合适的AMH 基因，优化使其适合于大肠杆菌中表达。构建质粒表达载体，利用化学诱导法使大肠杆菌成为感受态细胞，进行转化。将穿刺菌至于含卡那霉素（Kan）的培养基中37℃培养12～16 h，取菌液于含Kan 的LB（Luria-Bertani）细菌培养基上划线，37℃过夜培养。挑选出平板中淡黄色菌落，内含重组质粒的大肠杆菌，至于含抗性LB 液体培养基中培养4～6 h。完成后菌液分成两份，分别用于制备菌种和PCR 扩增和电泳分析。经PRC 鉴定和测序正确的菌液加入甘油，然后添加甘油并保存在-80℃。

取甘油菌至LB 液体培养基中培养过夜，37℃，220 rmp 振摇，至OD=0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-b-D-thiogalactoside，IPTG)，至终浓度梯度为0.5 mM。取500 μL 菌液作为负对照，IPTG 37℃下诱导表达4 h。收取菌体，经破碎、离心处理后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测AMH 重组蛋白的表达。优化表达条件后，进行AMH 蛋白大量表达，并对可溶性蛋白通过NI-NTA 亲和层析柱（GE）纯化，纯化的物质通过SDS-PAGE 电泳，并用考马斯蓝染色以评估其分子量，BCA 蛋白检测试剂盒测定AMH 蛋白的浓度。

1.4 动物免疫

以纯化后的AMH 重组蛋白为免疫原，首次AMH 重组蛋白与等体积的福氏佐剂充分乳化，分别50 μg，以100 μg/只的量于BALB/c 小鼠背部皮下多点注射免疫。二次、三次免疫同样使用50 μg AMH 重组蛋白与等量不完全福氏佐剂。每次免疫的时间间隔为两周，在三次免疫的一周后，采血、分离血清进行间接ELISA 以检测小鼠体内抗AMH 蛋白抗体的效价。选免疫效价高的免疫小鼠取脾，准备骨髓瘤-脾细胞融合实验。

1.5 细胞融合和杂交瘤细胞的筛选

细胞融合和杂交瘤细胞的筛选具体实验步骤请见参考文献［8］。经过3 次亚克隆后，即得到能稳定分泌特异性抗AMH 蛋白抗体的杂交瘤细胞株，并扩大培养于液氮保存。

1.6 单克隆抗体的制备［9］

单克隆抗体的制备实验具体步骤请见参考文献［9］。采用8～10 周龄的BALB/c 小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，抽取腹水后离心，Protein G 亲和纯化得到单克隆抗体。

1.7 单克隆抗体效价测定

使用ELISA 间接法［10］：①包被：将重组抗原以1 μg/mL，100 μL/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜；封闭：用PBST 洗净ELISA 板，加入200 μL/孔5%的脱脂奶粉，于37℃封闭2 h，以占据固相中未被重组抗原包被的位点，减少非特异性反应；③反应：洗板后，加入倍比稀释浓度的抗体（分别为500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8、0.0 ng/mL），100 uL/孔，置于37℃孵育1 h；④加入二抗：洗板后，加入适当稀释度的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，置于37℃孵育1 h；⑤显色：加入TMB 显色底物100 μL/孔，反应10 min；⑥终止：加入50 μL 2 mol/L 硫酸终止液终止反应；⑦读数：酶标仪于450 nm 处，读取各孔OD 值。

1.8 单克隆抗体的亚型鉴定

应用小鼠单克隆抗体亚型检测试剂条对抗体的亚型进行检测，根据使用说明书操作，将70 μL细胞培养上清加到试剂条的加样区，10 min 后，与参照卡比对，确定抗体亚型。

2 结果

2.1 AMH 重组蛋白的小量表达与纯化

经过37℃诱导表达4 h 和25℃诱导表达过液，菌体收集破碎，SDS-PAGE 分析（图1）发现，AMH蛋白主要在包涵体中表达。37℃条件下，表达量更高且更省时，所以以37℃诱导表达4h，进行大量表达。经SDS-PAGE 胶分析，NI-NTA 亲和层析柱纯化后的AMH 蛋白纯度达85%以上，蛋白分子量大约40 k 左右。见图2。

图1 AMH 蛋白小量表达Figure 1 Small amount of AMH protein expression

图2 SDS-PAGE 分析AMH 纯化蛋白Figure 2 The purified AMH protein demonstrated with SDS-PAGE

2.2 小鼠免疫效价测定

纯化的AMH 重组蛋白混合福氏佐剂用作免疫原，通过多次皮下注射使小鼠产生相应的抗体。免疫3 次后，小鼠取血进行抗体效价评估。在1∶128 000 处的OD 值超过阴性对照的OD 值的2.1 倍，而1∶256 000 时，OD 值小于阴性对照OD 值的2.1 倍，为阴性结果。见图3。

图3 小鼠血清免疫效价Figure 3 Analysis of the immunopotency of mouse serum

2.3 杂交瘤细胞株的筛选

于96 孔ELISA 板中选取阳性孔，经有限稀释法对其进行克隆化，3 次亚克隆后，即得到能稳定分泌特异性抗AMH 蛋白抗体的杂交瘤细胞株，得到2 株杂交瘤细胞，孔内上清抗体检测为阳性。将2 株能稳定分泌特异性抗AMH 蛋白抗体的杂交瘤细胞，分别命名为3F6、4E7。

2.4 单克隆抗体的纯化

经Protein G 亲和层析法纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE 电泳，图4 中可见55 kD、25 kD 两条清晰的条带，其中位于55 kD 的为抗AMH 重组蛋白抗体的重链，25 kD 为其轻链。

2.5 单克隆抗体效价测定、亚型鉴定

无菌抽取小鼠腹水，使用间接ELISA 法于450 nm 处定量检测腹水中抗体效价为6.25 ng/mL，见图5。使用亚型检测试纸条，可直观得出2 株单克隆抗体均为IgG1 型，见图6。

图4 单克隆抗体分析Figure 4 The analysis of monoclonal antibody with SDS-PAGE

图5 单克隆抗体的效价Figure 5 Concentration of 3F6 and 4E7 antibody

图6 抗体亚型鉴定Figure 6 The subtype identification of antibody

3 讨论

利用大肠杆菌作为原核表达的表达系统，可构建出AMH 基因的原核表达载体并诱导表达出AMH 蛋白。大肠杆菌的最适生长温度为37℃，在此温度下易生成包涵体蛋白。同时，包涵体的形成是目的蛋白表达量很高的表现。本项目采取降低IPTG 浓度并延长诱导时间的方法获得更多可溶蛋白。动物免疫制备单克隆抗体的过程中，若AMH 蛋白不纯会影响抗体的产生。采取多次多点注射以提高小鼠血清的免疫效价。经过3 次免疫的小鼠产生的抗体效价达1∶128 000。可认为此时小鼠体内产生抗AMH 重组蛋白的抗体的能力较为活跃，制备脾细胞悬液。于小鼠腹腔注射杂交瘤细胞前，注入降植烷可加速瘤细胞的生长。

本研究经对重组AMH 蛋白杂交瘤细胞采用有限稀释法连续进行3 次亚克隆，成功制备出2 株抗苗勒管激素单克隆抗体，并进行效价的测定和亚型的鉴定。方法步骤较繁琐，而且鼠源性的单克隆抗体有一定的应用局限性［9］。可有新颖、可行的方法供纯化单克隆抗体的应用［11］。血清中AMH 作为卵巢储备功能的血清标志物，具有预测卵巢储备、妊娠结局的功能［12-14］，高水平AMH 对卵巢颗粒细胞瘤的诊断有重要的意义［15］。同时，AMH 水平的高低比年龄更能准确地预测妇女的更年期［16］。制备出的抗苗勒管激素单克隆抗体可用于血清AMH 的定量检测，采用的检测原理为双抗体夹心法，将其应用于全自动免疫分析仪的试剂中。AMH 测量的可靠性和可重复性引起了许多疑问，自2014年以来，已经开发出自动加样提高AMH 测量的灵敏度和可重复性。自动化方法的准确度提高了四倍，速度更快需要的血清量更少［1］。但要注意用于检测的AMH 免疫测定法并未使用相同的抗体对，因此仍然有必要定义特定的参考值和临界点［6］，对检测结果解释不能一概而论。依据现今科技发生的速度，预测在不久将来，可将其应用于免疫层析试纸条的检测AMH。在这医学技术日益发展的今天，深入探究更多检测试剂核心原料的作用与来源，可通过现今技术，进行改良与优化，有利于推动检验技术的发展，惠及更多人群。