血清miR-200c表达与2型糖尿病患者白蛋白尿短期进展的相关性研究

庄苹 杨锦 郑蛟 张敏

2 型糖尿病是我国常见的内分泌代谢疾病且发病率呈逐年升高趋势，但2 型糖尿病患者的治疗情况不容乐观，血糖达标率低、并发症发病率高。糖尿病肾病是2 型糖尿病常见的慢性并发症，也是临床上终末期肾病最常见的病因之一［1-2］。糖尿病肾病的发生与血糖控制不佳、糖基化终末产物蓄积、炎症反应及氧化应激反应激活均密切相关［3-4］。近年来，越来越多的研究开始关注糖尿病肾病，多种风险因素也被证实与糖尿病肾病的发病有关，但目前国内关于糖尿病肾病的临床研究以横断面研究为主，未能对病情发展变化进行动态观察。

白蛋白尿是糖尿病肾病特征性的表现，本研究拟观察白蛋白尿短期进展情况来评价糖尿病肾病病情的动态变化并分析相关的危险因素。微小RNA（microRNAs，miRs）是一类具有广泛生物学作用的非编码小分子RNA，血清中多种miRs 表达异常被证实与糖尿病肾病的发生有关。刘新磊［5］研究证实，糖尿病肾病大鼠肾脏中miR-200c 的表达增加且抑制miR-200c 表达对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有保护作用。基于此，本研究将分析血清miR-200c表达与2型糖尿病患者白蛋白尿短期进展的相关性，旨在为阐明糖尿病肾病病情发展变化的可能机制、探寻预测病情发展变化的标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3月至2019年10月期重复收治本院入院的108 例2 型糖尿病患者标本。入组标准：①符合2 型糖尿病的诊断标准［6］；②连续两次住院的资料完整；③首次住院时留取血清并检测miR-200c。④所有患者及家属均已签署知情同意书；排除标准：①其他类型糖尿病或合并糖尿病急性并发症，如糖尿病酮症酸中毒、高血糖高渗状态；②合并原发性肾脏疾病；③合并恶性肿瘤；④有使用肾毒性药物病史。以第一次入院时的资料作为基线资料、第二次入院时的资料作为随访资料。根据第一次入院时的尿白蛋白水平分为无白蛋白尿组（＜30 mg/24 h）55 例、微量白蛋白尿组（30～300 mg/24 h）35 例、大量白蛋白尿组（≥300 mg/24 h）18 例。本实验已通过医院伦理委员会批准同意。

1.2 试剂与仪器

miRNA 提取分离试剂盒、miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRNA 荧光定量检测试购盒自北京天根公司，荧光定量PCR 仪为Bio-rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 基线和随访数据的收集

收集患者第1 次入院的病史资料，包括性别、年龄、糖尿病病程、体质量指数（Body mass index，BMI）、吸烟史、高血压史、用药情况、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL）、空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c%）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）、内生肌酐清除率（Glomerular filtration rate，eGFR）。

1.3.2 血清miR-200c 表达的检测

取首次住院期间留取的血清标本，采用miRNA 提取分离试剂盒分离血清中的miRNA，采用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒将miRNA 反转录为cDNA，采用miRNA 荧光定量检测试购盒配置PCR 反应体系并进行PCR 扩增，分别扩增miR-200c 及U6，根据扩增曲线计算miR-200c 的表达量。

1.3.3 白蛋白尿短期进展的评价

收集患者第2 次入院的病史资料，与第1 次入院时白蛋白尿的变化进行比较，同一患者由无白蛋白尿进展为微量白蛋白尿或大量白蛋白尿、由微量白蛋白尿进展至大量白蛋白尿、大量白蛋白尿患者Scr 水平翻倍均判断为白蛋白尿短期进展。共28 例患者发生白蛋白尿进展、作为白蛋白尿进展组，其余80 例未发生白蛋白尿进展、作为白蛋白尿非进展组。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0 软件进行分析，计数资料用n表示，计量资料以（）表示，多组间的比较采用方差分析、两组间的比较采用t检验，相关因素分析采用Logistic 回归分析，预测价值采用ROC 曲线分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 无白蛋白尿组、微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组患者一般资料的比较

3 组间性别、年龄、BMI、吸烟率、用药情况等差异无统计学意义（P＞0.05）；与无白蛋白尿组、微量白蛋白尿组比较，大量白蛋白尿组患者的糖尿病病程明显延长（P＜0.05），高血压率明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 无白蛋白尿组、微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组患者实验室指标的比较

表1 3 组间一般资料的比较［n（%）］Table 1 Comparion of general data among 3 groups［n（%）］

3 组间TC、TG、LDL-C、HDL-C 差异无统计学意义（P＞0.05）；与无白蛋白尿组、微量白蛋白尿组比较，大量白蛋白尿组患者的FBG、HbA1c%、Scr、eGFR、miR-200c 均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3 组间实验室指标的比较［n，（±s）］Table 2 Comparion of laboratory indicators among 3 groups［n，（±s）］

表2 3 组间实验室指标的比较［n，（±s）］Table 2 Comparion of laboratory indicators among 3 groups［n，（±s）］

资料TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）FBG（mmol/L）HbA1c%Scr（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73 cm2）］miR-200c无白蛋白尿组（n=55）1.77±0.32 4.77±0.78 2.29±0.52 1.28±0.29 6.29±0.95 6.83±0.97 60.19±9.95 114.49±26.96 0.69±0.26微量白蛋白尿组（n=35）1.64±0.35 4.49±0.81 2.50±0.77 1.19±0.31 7.58±1.15 7.34±1.25 67.58±12.58 100.19±31.48 0.86±0.28大量白蛋白尿组（n=18）1.83±0.39 4.84±0.92 2.56±0.69 1.22±0.34 8.11±1.48 8.65±1.94 86.96±14.58 85.68±14.85 1.08±0.29 F 值2.329 1.635 1.807 0.981 24.724 14.073 35.633 8.544 14.855 P 值0.102 0.200 0.169 0.378 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 白蛋白尿进展组与非进展组患者一般资料的比较

两组间性别、年龄、BMI、糖尿病病程、吸烟率、用药情况差异无统计学意义（P＞0.05）；与非进展组患者比较，进展组患者高血压率均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 白蛋白尿进展组与非进展组患者实验室指标的比较

两组TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、HbA1c%差异无统计学意义（P＞0.05）；与非进展组患者比较，进展组患者Scr、eGFR、miR-200c 均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 两组间一般资料的比较［n（%）］Table 3 comparion of general data among 2 groups［n（%）］

表4 两组间实验室指标的比较［（±s），mmol/L］Table 4 Comparison of laboratory indicators between the two groups［（±s），mmol/L］

表4 两组间实验室指标的比较［（±s），mmol/L］Table 4 Comparison of laboratory indicators between the two groups［（±s），mmol/L］

资料TC TG LDL-C HDL-C FBG HbA1c Scr eGFR［mL/（min·1.73 cm2）］miR-200c白蛋白尿非进展组（n=80）1.73±0.30 4.69±0.84 2.41±0.70 1.20±0.31 7.51±1.18 7.55±1.32 73.48±12.77 110.48±28.48 0.73±0.15白蛋白尿进展组（n=28）1.85±0.41 4.91±0.96 2.57±0.68 1.29±0.35 8.08±1.78 8.22±2.19 83.98±14.29 87.12±16.48 1.05±0.33 t 值1.649 1.149 1.049 1.278 1.911 1.922 3.630 7.704 5.346 P 值0.102 0.253 0.297 0.204 0.059 0.057 0.001 0.000 0.000

2.5 白蛋白尿短期进展影响因素的logistics 回归分析

以白蛋白尿短期进展为应变量，以结果2.3 及2.4 中有统计学差异的高血压、Scr、eGFR、miR-200c 为自变量进行Logistics 回归分析，高血压及miR-200c 增加是白蛋白尿短期进展的危险因素，差异具有统计学意义（P＜0.05），Scr、eGFR 与白蛋白尿短期进展无明显相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 白蛋白尿短期进展影响因素的Logistics 回归分析Table 5 Logistic regression analysis of finfluence actors of short-term progress of albuminuria

2.6 miR-200c 预测白蛋白尿短期进展的ROC 曲线分析

miR-200c 预测白蛋白尿短期进展的ROC 曲线下面积为0.7663（95%CI：0.6647～0.8679），根据约登指数最大值确定最佳截点为：0.865，该截点预测白蛋白尿短期进展的灵敏度为64.29%、特异性为71.25%。见图1。

3 讨论

糖尿病肾病是临床常见的糖尿病慢性并发症之一，严重影响患者的生活质量，也增加了终末期肾脏病的发病风险。白蛋白尿是糖尿病肾病的特征性表现之一，随着病情的发生、白蛋白漏出增多、白蛋白尿加重。多项研究证实，糖尿病患者尿白蛋白排泄增加不仅与糖尿病肾病的预后有关，还与糖尿病患者大血管病变、视网膜病变、骨代谢异常的发生密切相关［7-9］。因此，通过危险因素筛查早期识别糖尿病患者中可能发生白蛋白尿加重的高危人群具有积极的临床意义。

图1 miR-200c 预测白蛋白尿短期进展的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of miR-200c in predicting short-term progress of albuminuria

在王婷婷［10］的研究中，24.6%的2 型糖尿病患者发生率白蛋白尿短期进展。本研究采用进行了2 型糖尿病患者白蛋白尿短期进展的随访证实是糖尿病患者白蛋白尿短期进展的危险因素之一。在糖尿病肾病的发生中，高血压也被证实是危险因素之一，血压升高能够通过引起肾小球硬化、影响肾小球灌注等途径来参与肾损害的发生［11-12］。本研究的结果则进一步提示高血压不仅与糖尿病肾病的发生有关，还能促进糖尿病肾病的病情发展、与白蛋白尿短期进展相关。

近年来，多种血清标志物被用于糖尿病肾病病情的评价，其中miRs 是一种非编码小分子RNA，在转录后水平调节基因表达，在糖尿病肾病的发生发展中起到保护作用或促进作用［13-16］。刘新磊［6］的动物实验证实，糖尿病肾病大鼠肾脏中miR-200c 的表达增加；外源性使用miR-200c 的抑制物后，糖尿病肾病大鼠肾损害减轻、活性氧生成减少、TGF-β1 表达下调，提示miR-200c 可能在糖尿病肾病的发生发展中起到促进作用。在糖尿病肾病大鼠中，抑制miR-200c 表达能够起到抗氧化、抗纤维化的作用。

综上所述，2 型糖尿病患者血清miR-200c 表达增加与白蛋白尿的产生、加重及短期进展均相关，血清miR-200c 表达增加是2 型糖尿病患者白蛋白尿短期进展的危险因素且对白蛋白尿短期进展具有预测价值。