GAP-43蛋白表达与大鼠心力衰竭发病相关性分析

王娜 陈玉善 刘蕾 杜林翔 王书飞 左艳芳 李宗赢 李婷婷

心力衰竭（heart failure，HF）是指各种原因导致的心脏组织重构、心功能降低临床表现为心室充盈、心室射血分数降低等的一种临床综合征，是常见的心血管系统疾病［1］。其发病率呈逐年上升趋势。据流行病学资料估计，全国卒中患者不低于700 万，心衰患者约450 万左右，是常见的心血管患者死亡的主要原因［3-4］，慢性心衰患者住院30 d 死亡率达5.4%［5］。其发病机制，主要由于心输出量减少，心腔压力增加而激动神经体液调节机制，交感神经兴奋，肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，释放大量去甲肾上腺素，心肌应激性增强而触发恶性室性心律失常，严重导致心源性猝死［6］。神经生长相关蛋白-43（growth-associated protein 43，GAP43）是神经系统发育过程中高度表达的一种神经组织特异性磷酸蛋白质，参与轴突生长和突触形成，是神经再生表达过程中的典型特征，可作为神经生长状况的反映性标志物。GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平可反映神经重构水平，参与HF 发生发展机制［7］。为进一步确定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平在HF 诊断中的价值，本研究应用心脏超声评估大鼠左心室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF），应用qRT-PCR 方法检测心脏组织GAP-43mRNA表达，Western blot检测心脏组织GAP-43蛋白表达，试图探讨GAP-43蛋白的表达及其在心力衰竭发病机制中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取清洁级Wistar 大鼠30 只，3月龄，体重180～200 g，雌雄各半，购自广东省实验动物中心，使用许可证号：SYXK（粤）2013-0002，自由摄食和饮水，昼夜交替各12 h，随机分为模型组和假手术组，每组各15 只，其中模型组造模过程中死亡4只。SPF 级Wistar 大鼠48 只，雌雄不限，体质量（200±20）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK2010-0001。大鼠购入后，适应性饲养1 周，动物室保持室温（20±2）℃，相对湿度45%，12 h 昼夜节律，自由饮水，常规颗粒饲料喂养，隔天更换一次垫料。

1.2 实验方法

1.2.1 干预方法

手术组大鼠参见文献建立DHF 模型［1］。手术严格无菌操作，每只大鼠术后给予30 万U/（kg·d）青霉素肌肉注射3 d，预防感染，术后精心饲养。术后第8周开始，使用微升注射器，静脉注射右下肢 急性心衰药物RLX，RLX 小剂量组为30 μg/（kg·d），RLX 大剂量组为98 μg/（kg·d），给药时间2 周。而非手术组应用生理盐水以HF 组相同的方法、体积和时间进行注射。

1.2.2 心脏超声检查

2%戊巴比妥钠以腹腔注射的方式（Sigma 公司，批号T0894）进行静脉麻醉，固定每组大鼠的四肢，仰卧位。采用彩色超声诊断仪（SONOS5500，Hewlett-Packard 公司）探头选用动物专用小探头（15 MHz，型号：Vevo 770）进行二维超声的心脏形态和功能检测，扫描范围：大鼠胸骨旁。测量指标包括左心室射血分数（LVEF）、左心室舒张末容积（Left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收缩末容积（left ventricular end-systolic volume，LVESV）。

1.2.3 qRT-PCR 检查

总RNA 提取：按照Trizol 试剂盒（Invitrogen，美国，批号：15596-026）说明书进行，向大鼠心脏组织中加0.4 mL 的Trizol 试剂后匀浆，再加入1/5 Trizol 试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀，室温下静置5 min，4℃，12 000 g 离心15 min，取上清液至新离心管内，加入与上清液等体积量的异丙醇，颠倒混匀，室温下静置10 min，4℃，12 000 g 离心10 min，其上清液。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，12 000 g，4℃离心5 min，其上清液保留沉淀并干燥。RNA OD 值A260/A280 在1.7～2.1为合格。PCR 扩增：按照反转录试剂盒（广州瑞真生物有限公司，批号：RR047Q）说明书进行DNA 反转录；以反转录cDNA 产物为模板，按照实时荧光定量PCR 试剂盒（广州瑞真生物有限公司，批号：RR430S）说明书进行荧光定量测定。PCR 反应体系如下：预变性30 s，95℃；扩增、延伸15 s，95℃；退火30 s，60℃，循环40 次，上游引物：ATTCAGGCTAGCTTCCGTGG，下游引物：GAAGGTGCATCTCCTGCCTT，产物片段为218 bp。

1.2.4 Western blot 检查

取50 mg 分离得到的左心室组织的蛋白质，BCA 法（bicinchoninic acid）测量其蛋白浓度，将蛋白进行电泳、转膜、GAP-43 一抗孵育（稀释比例1∶400，武汉博士德生物试剂公司提供）、二抗孵育、杂交、显影、曝光，所需的Western、IP 细胞裂解液、PMSF、增强型BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。条带灰度值采用Image J 图像分析软件分析处理。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料采用（）表示，组间比较使用t检验，相关性分析Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠体质量比较

模型组和假手术组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组大鼠体质量比较［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

表1 两组大鼠体质量比较［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

组别模型组假手术组n 11 15体质量（g）194.49±10.20 191.18±9.22 t 值0.865 P 值0.396

2.2 两组造模后4 周心脏组织GAP-43 mRNA 和蛋白表达

模型组心脏组织GAP-43mRNA 和蛋白相对表达量明显低于假手术组，差异比较有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

表2 两组造模后4 周心脏组织GAP-43 mRNA 和蛋白表达［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

表2 两组造模后4 周心脏组织GAP-43 mRNA 和蛋白表达［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

注：A.模型组；B.假手术组

组别模型组假手术组t 值P 值n 11 15 GAP-43 mRNA相对表达量0.300±0.073 0.902±0.089 18.335 0.000 GAP-43蛋白相对表达量0.373±0.043 1.210±0.133 20.023 0.000

2.3 两组造模后4 周后LVEF 比较

模型组造模4 周后LVEF 明显低于假手术组，差异比较有统计学意义（P＜0.05），见表3。

图1 模型组和假手术组大鼠心脏组织gap-43蛋白的western blot 分析Figure 1 Western blot analysis of GAP-43 protein taken from heart tissue of rats in model group and sham-operated group

表3 两组造模4 周后LVEF 比较［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

表3 两组造模4 周后LVEF 比较［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

组别模型组假手术组n 11 15 LVEF（%）20.44±2.01 70.28±3.62 t 值41.110 P 值0.000

2.4 相关性分析

将模型组GAP-43mRNA 和蛋白相对表达量与LVEF 进行相关分析，结果显示：GAP-43mRNA相对表达量与LVEF呈负相关（r=-0.707，P＜0.05），GAP-43蛋白相对表达量与LVEF 呈负相关（r=-0.600，P＜0.05）。见图2。

图2 心力衰竭大鼠GAP-43 mRNA 和蛋白相对表达量与LVEF 相关图Figure 2 Analysis of correlation between relative expression of GAP-43 mRNA and protein and LVEF

3 讨论

多数学者认为，HF 致交感神经兴奋，神经组织重构可引起以室性心律失常为代表的各种心律失常临床表现症，严重可引起患者心源性猝死。故神经重构在HF 疾病进展过程中起着重要作用。目前关于神经重构致交感神经过度兴奋相关性猝死的发病机制并未完全阐明，交感神经重构、心肌重构等相互作用一直被认为是心衰的主要发病机制［8］。有研究报道［9］HF 患者早期表现为交感神经兴奋，去甲肾上腺素分泌增多，出现功能性交感神经去支配等现象，表现为反射性分泌去甲肾上腺素和酪氨酸羟化酶的水平下降，神经对去甲肾上腺素的重吸收能力降低，相应地，所需的去甲肾上腺素吸收载体-1 密度降低，最终使患者交感神经功能下降甚至丧失，长时间的心脏抑制作用，可加重心衰，严重导致死亡［10］。临床上有研究报道［11］血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）类药物可缓解患者的交感神经去支配现象，β 受体阻断剂对临床各种心律失常、提高室颤阈值、膜稳定、减少猝死等方面具有重要作用。目前已得到临床的广泛应用，具体作用机制尚不明确，可能与减慢心率、降低异位起搏点兴奋性、延长房室结不应期、减慢传导等具有密切关系。但仍需进一步研究。

GAP-43 是神经元上特异性的轴突膜蛋白质，又称neuromodulin，参与神经细胞生长、突触生成发育和神经细胞再生，在神经元的发育和再生过程中起着重要作用，同时，GAP-43 作为细胞内信号分子，调节轴突延伸作用，间接影响信号传导途径，也可通过增强与G 蛋白偶联受体的转运作用，直接促进细胞内的信号传导。近年来，大量文献报道，利用GAP-43 水平反映心肌细胞功能，是判断交感神经重构常用的指标［13］，故在心衰相关性基础研究中具有一定作用。本研究结果显示，心力衰竭模型组大鼠血清GAP-43mRNA、GAP-43蛋白水平较假手术组大鼠血清中上述指标显著降低，与既往研究报道一致［14］。有文献报道［15］通过给心力衰竭大鼠灌注益气活血中药后较治疗前发现血清GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平显著下降，对心功能指标检测发现LVEF 提高，大鼠心衰症状得到明显改善。以往研究报道虽给出相同的结论，但并未进一步分析心脏功能与GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平的关系。本研究结果显示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 与LVEF 间均呈负相关。提示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 越高，心功能越差。由此可作为心衰病情评估的指标，对临床诊断和个性化治疗方案的确定具有重要意义。

综上所述，心力衰竭大鼠心脏组织GAP-43mRNA 和蛋白相对表达量明显下调，与心功能有一定关系，在疾病发生发展中有重要作用。本研究创新处，不仅确定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA水平在心衰诊断中的价值，还得出其与心功能的关系，对临床诊治具有重要的指导意义，可推进心衰治疗的临床发展。本研究不足之处，样本量有限，需扩大样本进一步深入实验。