黄曲霉菌在玉米不同生育期中侵入时期的研究

王 伟，吴翠平，李 潘，谢文静，孙小芳，祁小波，龚国淑

(四川农业大学农学院，成都 温江 611130)

黄曲霉菌(Aspergillusflavus)在自然界中广泛存在，对人畜可致病，同时还能侵入玉米、花生、坚果等作物，降低产品品质，造成严重的经济损失[1]。黄曲霉菌还能产生黄曲霉毒素(Aflatoxins)，包括B族、G族和M族等，具有强致癌性，可引起人畜急性中毒和肝脏癌变。20世纪60年代，英国轰动一时的“火鸡事件”将黄曲霉菌首次曝光，成为研究黄曲霉菌的开端[2-5]。在玉米上，黄曲霉菌主要危害果穗，引发玉米黄曲霉穗腐病。由于黄曲霉菌产孢量大，生长温度、湿度条件宽泛，在玉米生产上常大面积发生黄曲霉穗腐病，严重影响玉米产量；此外，黄曲霉菌在玉米收获后交互侵染，使贮藏期玉米品质严重下降[6]。近年来，四川地区玉米黄曲霉穗腐病日趋严重，通过探究黄曲霉菌在玉米生育时期中的侵入时期，抓住关键时期对玉米黄曲霉穗腐病进行预防，对提高玉米产量和品质有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米品种：正红505。

仪器及工具：超净工作台、灭菌锅、接种铲、一次性针头注射器、显微镜、血球计数板等。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂粉15g，水1000mL。

试验地点：四川省崇州市四川农业大学现代农业研发基地。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离 于2018年在四川农业大学现代农业研发基地进行样品采集，带回实验室进行组织分离，得到的分离物在25℃下培养3d，将单菌落边缘幼嫩菌丝转移至新的PDA培养基上，于28℃上继续培养3d，重复2次，将菌株保存于PDA斜面上，4℃保存。

1.2.2 田间设计 共设置7个玉米生育时期和1个空白对照处理。每个处理接种20株，玉米行距80cm，株距40cm，每个处理种植2行，每行20窝，重复3次。各玉米生育时期分别为拔节期、扬花期、吐丝期、灌浆期、乳熟期、腊熟期、完熟期。

1.2.3 黄曲霉菌在玉米生育期中侵入时期的探究 将黄曲霉菌从试管中活化于PDA上，30℃培养3d，将幼嫩菌丝转接到新的PDA上，30℃培养5d。将培养好的菌用0.01%Triton X-100溶液洗涤分生孢子，用血球计数板在显微镜下计数为1×106spore/mL。将准备好的孢子悬浮液在低温中进行运输。用10mL的一次性针头注射器将孢子悬浮液沿着玉米穗子分化处(拔节期)、玉米穗子(剩余6个时期)的位置进行注射，每个处理接种20株，套袋，对照组用同样的方法注射等体积的无菌水。在玉米完熟后10d收获，统计观察。

2 结果与分析

2.1 玉米不同生育期接种黄曲霉菌动态观察

通过对玉米拔节期、扬花期、吐丝期、灌浆期、乳熟期、腊熟期和完熟期7个生育时期接种黄曲霉菌发现，随着玉米生育期的推移，最终累计在玉米果穗上的黄曲霉菌逐渐增加。从黄曲霉从扬花期开始有少量积累，但在吐丝期开始大量积累。但腊熟期和完熟期相对乳熟期和灌浆期较低，可能与接种天数有关。结果表明：黄曲霉菌在扬花期后开始逐渐侵入玉米果穗。

2.2 玉米不同生育期接种黄曲霉菌后病情指数统计

通过对玉米拔节期、扬花期、吐丝期、灌浆期、乳熟期、腊熟期和完熟期7个生育时期接种黄曲霉菌后统计发病率和病情指数发现，在拔节期时，玉米发病率为0，在扬花期发病率为25%，当在吐丝期，发病率为85.71%，相对扬花期显著增加。直到灌浆期后，发病率为100%。另一方面，在扬花期病情指数为6.94，到吐丝期病情指数显著增加，为38.10；灌浆期病情指数达到最大值，为47.47；随后病情指数降低。从发病率可以看出，当灌浆期以后，发病率为100%，表明每个穗子接种成功。但灌浆期以后病情指数下降，则与接种时间与调查时间的差值相关。

3 讨论

探究黄曲霉在玉米植株上侵入时间对预防玉米黄曲霉穗腐病有着重要的意义，前人研究证明黄曲霉菌侵入玉米时期为吐丝期[7]。但因地理位置多样性，黄曲霉菌的变异可能性增加，不同地区黄曲霉菌的属性可能不同，我们针对四川省崇州地区再次验证黄曲霉菌侵入玉米的生育时期，对四川地区玉米黄曲霉穗腐病的预防有着重要意义。研究结果表明，黄曲霉菌在玉米扬花期开始有少量积累，吐丝期积累量增加，灌浆期积累量显著增加，并达到最大值。在扬花期接种黄曲霉菌的玉米发病率为25%，当到达吐丝期后，玉米发病率为85.71%，到灌浆期后发病率为100%。因此，黄曲霉菌主要从玉米花丝通道侵入。玉米从营养生长转变为生殖生长后，当花丝器官成熟时，黄曲霉菌开始在花丝器官上着生，当玉米果穗成熟后即腊熟后开始着生于玉米籽粒上。本试验结果表明灌浆期后玉米黄曲霉开始大量积累，而腊熟或者完熟时黄曲霉的积累量降低。其原因在于灌浆期到生理成熟后期时间间隔约60d，而完熟期至调查时期仅10d，病原菌在果穗上的生长时间对在果穗上的积累量有着重要的影响。扬花期及吐丝期的病原菌积累量不多，这可能与接种黄曲霉后，随着时间的推移，黄曲霉菌部分死去，导致病原菌量积累较少。