枯草芽孢杆菌酶的还原性能及用于靛蓝染料还原

廖 欢,吴艳丽,2,周 亭，陈建芳

(1.湖南工程学院 材料与化工学院，湘潭 411100；2.德永佳纺织制衣有限公司，东莞 523000)

靛蓝染料作为一种还原染料，因牢度优良，尤其是耐日晒和耐皂洗色牢度，被广泛应用在纤维素纤维上[1-3].但该类染料不溶于水，不利于后续染色，通常改进措施是将其分子共轭双键系统中的羰基在碱性溶液中与保险粉(连二亚硫酸钠)相互作用，羰基还原转变成羟基，成为可溶于水的隐色体[4-6].同时，保险粉在反应过程中，被氧化成硫酸盐等一系列含硫物质，而这些含硫物质不能回收再利用，只能随着印染废水排放到自然界中，降解后会产生H2S，污染大气[7-8].目前，有研究还原染料间接电化学染色利用电化学还原代替保险粉的工艺，刘祥霞[9]等利用葡萄糖作为靛蓝染料的还原剂，测定了葡萄糖在不同还原体系中分子结构的变化，且优化了还原及染色工艺.谭晓冬[10]使用超声波对靛蓝进行超声电化学还原，并运用新型铁-三乙醇胺-葡萄糖酸钙(Fe-TEA-Ca)络合体系作为媒介，以达到染色目的.以上研究均有特色，但是前者存在染色时间长，上染率偏低，而后者操作复杂且设备占地面积大等问题.

针对以上问题，本文通过制备具有还原性的枯草芽孢杆菌酶，并测试其在靛蓝染料体系中的还原能力，尝试在电化学还原中使用更环保的生物酶-蒽醌还原体系，为后续生物酶运用于电化学还原染色研究提供基础.目前，暂未见关于生物酶运用到电化学还原靛蓝染料的相关研究报道.

1 实验部分

1.1 实验材料与试剂

枯草芽孢杆菌(生化试剂，郑州华冠生物技术开发有限公司)；蛋白胨、琼脂粉、酵母浸粉(均为生化试剂，北京普博欣生物试剂公司)；靛蓝(化学纯，徐州开达精化有限公司)；1,8-二羟基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ，分析纯，西格玛奥德里奇贸易有限公司)；Tris(三羟甲基氨基甲烷，色谱纯，北京普博欣生物科技责任有限公司)；氢氧化钠、硫酸、氯化钠、磷酸钠(均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司).

1.2 主要实验仪器与设备

LRH-150B生化培养箱、YX系列全温振荡器、TS-211B光照摇床、JY92-II超声波细胞粉碎机、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌箱、722型分光光度计、TK-98022868型台面式pH/ISE测试仪、COO2天津艾达恒晟电解池.

1.3 培养基的配方与配制

枯草芽孢杆菌的培养基配方如表1所示.

表1 枯草芽孢杆菌的培养基配方

枯草芽孢杆菌的培养：

用1 L的三角锥形瓶按照以上处方配制500 ml的标准培养液，用纱布封口后在立式压力蒸汽灭菌箱内灭菌20 min.待灭菌完成后，温度降至60 ℃时在单人单面净化台上接种枯草芽孢杆菌.接种完后将培养液放入转速为160 rpm、温度为37 ℃的水浴振荡器中培养12 h，再将培养液取出，进行第一次离心.离心后将培养液和细胞分开，培养液可直接用于实验，细胞则用pH为7的磷酸钠盐缓冲液溶解，用超声波细胞粉碎机将细胞粉碎，再采用0.22 μm的滤纸和无油真空泵进行过滤，过滤后的酶液留作实验[11-12].

1.4 还原酶的定位

枯草芽孢杆菌不仅分泌胞内酶，还有胞外酶，实验需要的是具有还原性的酶.通过将培养液和辅酶NADH结合，再与1,8-DHAQ作用，看溶液的导电性及还原能力是否符合靛蓝还原染色的要求定位还原酶.电解液配制：各取5 mL枯草芽孢杆菌胞内酶与胞外酶培养液分别加入1.8 mM/L的辅酶(NADH)，用Tris-HCl缓冲溶液混合，将0.06 mM/L的1,8-DHAQ用Tris-HCl缓冲液溶解，将酶混合液与1,8-DHAQ溶液混合，再将混合后的溶液分别定容至100 mL.

1.5 还原能力的测定1.5.1 电子传递能力测试

闭合回路中的电流大小反映溶液的导电能力，因此实验通过测试外电流的大小来表示溶液的导电能力.实验在闭合回路中接入一个万用表和电流表，将配制好的电解液放入电解池中，通过调节外加电压来改变回路中的电子传递能力.将电源电压调至1 V、3 V…15 V，记录不同外电压下的电流值，平行测试3次，取平均值.

1.5.2 还原电位的测试

用868型台面式pH/ISE测试仪测试体系的还原电位.接通电路，将电源电压分別调至1 V，3 V…15 V，测试电解液的还原电位.

1.5.3 染料还原效果的测试

测试完还原电位后，向电解液中加入1 g靛蓝，每隔10 min各取三组1 ml的染液样品，一共取6次(0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)，用容量瓶定容至50 ml，再用分光光度计测试其吸光度，平行测试3次，取平均值.

2 结果与讨论

2.1 枯草芽孢杆菌酶的电子传递能力

由于溶解酶体系的Tris-NaOH(pH=11)缓冲溶液本身有导电性，所以测试酶液的导电性之前必须测试Tris缓冲溶液的导电性.再向Tris-NaOH(pH=11)缓冲溶液中分别加入含胞外酶与胞内酶的培养液，温度为60 ℃，具体测试结果如表2所示.

表2 Tris-NaOH(pH=11)缓冲溶液与含枯草

由表2可知，Tris-NaOH缓冲溶液具有一定的导电能力，当缓冲液中加入胞外酶后，电流基本保持不变，这说明胞外酶基本没有传递电子能力.同时，含有胞内酶的电解液随着外加电压的增大，电流也在增大，当外加电压达到15 V时，电流数值是胞外酶的131倍.说明胞内酶电子传递能力远高于胞外酶，因此只有胞内酶才具有输送电子能力.

2.2 枯草芽孢杆菌酶的还原电位

首先测试100 mL Tris-HCl缓冲溶液在不同的外压下还原电位的变化情况，测试完Tris-HCl缓冲溶液的还原电位后分别向缓冲溶液中加入过量的胞内酶液与胞外酶液，pH调节至11，温度至60 ℃，测试不同外压下还原电位的变化情况，具体测试结果如表3所示.

表3 Tris-HCl缓冲溶液与含枯草芽孢杆菌酶溶液还原电位随时间及电压的变化

备注：“+”表示氧化，“-”表示还原.

由表3可知，胞内酶的还原电位随外加电压增大，电位也在增加，而胞外酶基本无变化. 当外加电压达到15 V时，胞内酶的还原电位为867 mV，高于靛蓝所需要的还原电位760 mV，因此可用作靛蓝电化学染色体系的还原剂.

2.3 pH值对枯草芽孢杆菌胞内酶电子传递能力的影响

测试温度为60 ℃，在不同pH值条件下，胞内酶的电子传递能力，具体结果如表4所示.

表4 不同pH值胞内酶溶液的电子传递能力测试表

由表4可知，酶体系在pH为11时导电能力最强，原因是胞内酶在pH值为11时活性最强；另外1,8-二羟基-9,10-蒽醌不溶于中性或酸性水溶液中，在强碱性条件下溶解度较大，因此，溶液中溶解较多蒽醌也是导电性增强的原因之一.

2.4 酶体系还原染料效果

采用酶体系还原靛蓝染料，并测定不同时间点隐色体的吸光度，具体结果如表5、图1所示.

表5 酶体系隐色体吸光度

图1 酶体系隐色体吸光度

从图1可知，随着时间的推移，溶液中的隐色体浓度不断增大，当还原时间为40 min时，隐色体浓度达到最大，测试出的最大吸光度为0.402.在生物酶体系中，辅酶(NADH)先和枯草芽孢杆菌中提取的酶液形成络合体系，此络合体系中的NADH-还原酶先失去一个氢，变为NAD-还原酶体，NAD-还原酶体系不稳定，当接触到阴极铜管时，Cu给出一个电子使其变成稳定的NADH还原酶结构，NADH还原酶将失去的电子传给了1,8-二羟基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ)，得到电子后，蒽醌中的羰基变为羟基，被还原的蒽醌遇到靛蓝，将电子传递给靛蓝，靛蓝首先被还原成不溶于水的隐色酸，隐色酸遇见氢氧化钠变为可溶性的隐色体钠盐.当还原时间超过40 min后，吸光度出现较小的下降趋势，可能是生成的隐色体被氧气氧化所造成.

3 结论

通过培养枯草芽孢杆菌，分泌出酶，由测试可知具有还原能力的酶是胞内酶，当生物酶体系的外加电压调至15 V时，胞内酶的还原电位为867 mV，高于靛蓝所需要的还原电位760 mV，可用做靛蓝电化学染色体系的还原剂，且酶体系温度为60 ℃，pH为11，还原时间为40 min时，对靛蓝染料的还原效果最佳.