左室射血分数保留的心力衰竭并发肺动脉高压患者血浆miR-21水平变化及其意义

周松，孙云静，崔江漫，狄宁宁

邢台市第三医院，河北邢台054000

心力衰竭是各种病因所致心脏疾病的终末阶段，主要表现为呼吸困难、乏力、体液潴留等，可影响循环、呼吸等系统功能，严重者甚至危及生命。临床上约50%心力衰竭患者可出现心肌间质纤维化和心室肥厚，导致心室顺应性下降、心室充盈压升高、肺循环淤血等，而左室射血分数是正常的或接近正常的，这部分病例被称为左室射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)患者[1,2]。肺动脉高压(PAH)是指肺动脉压力升高超过正常范围、肺血管阻力进行性增加的一种病理状态[3]。有研究报道，超过2/3的心力衰竭患者可能合并PAH，而心力衰竭患者一旦合并PAH，其死亡风险明显增加[3]。因此，早期诊断心力衰竭合并PAH，从而制定针对性干预措施，对改善患者预后具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类进化上高度保守、长度为21～25个核苷酸的单链小分子RNA，不编码蛋白质，但能通过抑制基因表达参与调控许多重要的病理生理过程，如细胞增殖、分化、凋亡及恶性肿瘤的发生、发展等[4～6]。miR-21属于miRNA家族成员之一。近年研究发现，在心力衰竭患者成纤维细胞中miR-21表达上调，其异常表达可促进心肌纤维化和左心室肥厚[7]。由此推测，miR-21异常表达可能与HFpEF合并PAH有一定关系，但目前缺少相关证据。为此，本研究观察了HFpEF并发PAH患者血浆miR-21水平变化，并分析其对HFpEF并发PAH的诊断价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年12月～2019年7月邢台市第三医院收治的HFpEF患者138例。所有患者符合2013年美国心脏病学学院基金会/美国心脏协会《心力衰竭治疗指南》中关于HFpEF的诊断标准[8]。纳入标准：①具有典型心力衰竭症状和体征，左室射血分数≥50%，心脏超声、心导管检查提示左心室舒张功能异常；②接受心脏多普勒超声检查；③临床病历资料完整。排除标准：①左室射血分数<50%的心力衰竭者；②合并急性心肌梗死、肥厚型梗阻性心肌病、先天性心脏病等可能影响本研究结果的其他心脏疾病者；③合并急慢性炎症反应性疾病或自身免疫性疾病者；④妊娠期或哺乳期妇女。根据是否合并PAH[平均肺动脉压>25 mmHg和(或)肺动脉收缩压(PASP)>35 mmHg且肺动脉楔压(PCWP)<15 mmHg][9]分为HFpEF合并PAH组(PAH-HFpEF组)62例、HFpEF组76例。其中，PAH-HFpEF组男37例、女25例，年龄(61.93±10.22)岁，BMI (23.45±1.17)kg/m2；HFpEF组男43例、女33例，年龄(61.28±9.16)岁，BMI(23.04±1.39)kg/m2。同期选择性别、年龄与HFpEF患者匹配的、在邢台市第三医院体检健康的志愿者40例(对照组)，男23例、女17例，年龄(61.50±10.24)岁，BMI(23.27±1.28)kg/m2。三组性别、年龄、BMI具有可比性。本研究经邢台市第三医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属知情同意。

1.2 血浆miR-21检测 HFpEF患者入院次日采集清晨空腹肘静脉血5 mL，EDTA抗凝，室温静置30 min。采用QIAGEN miRNeasy Mini Kit提取血浆miRNA，并通过QIAGEN miScript Ⅱ RT Kit逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，按荧光定量PCR扩增试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：miR-21上游引物5′-GTTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′，扩增片段长度95 bp；内参U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTC-3′，扩增片段长度95 bp。PCR反应体系共20 μL：2×Taqman通用PCR预混物10 μL，20×miRNA特异性引物1 μL，cDNA 1.33 μL，不含酶蒸馏水7.67 μL；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共50个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-21相对水平。实验重复3次，取平均值。对照组于体检当日采集清晨空腹肘静脉血，同法检测血浆miR-21相对水平。

1.3 超声心动图检查 采用Philips iE33型彩色多普勒超声诊断仪，S5-1探头，探头频率1.7～3.4 MHz。嘱受检者左侧卧位，平静呼吸，在左心室长轴切面采用M型超声测量左心房收缩末期内径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)。以Devereux校正公式计算左心室质量，进一步计算左心室质量指数(LVMI)。采用三尖瓣反流压差法估测PASP，PASP=4V2+右心房压力。其中，V为三尖瓣反流速度，右心房压力通过下腔静脉超声获得。

2 结果

2.1 各组血浆miR-21水平及LVEDD、LAD、LVMI、PASP比较 见表1。

表1 各组血浆miR-21水平及LVEDD、LAD、LVMI、PASP比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与HFpEF组比较，#P<0.05。

2.2 HFpEF患者血浆miR-21水平与LVEDD、LAD、LVMI、PASP的关系 Pearson积矩相关分析显示，HFpEF患者血浆miR-21水平与LAD、LVMI、PASP呈正相关关系(r分别为0.578、0.632、0.671，P均<0.05)，而与LVEDD无明显相关性(P>0.05)。

2.3 血浆miR-21对HFpEF并发PAH的诊断效能分析 ROC曲线分析显示，血浆miR-21诊断HFpEF并发PAH的曲线下面积为0.929(95%CI：0.892～0.966)，最佳截断值为2.35，此时其诊断敏感性为85%、特异性为93%、准确性为88%。

3 讨论

PAH是指肺动脉压力升高，而左心房与肺静脉压力正常，主要由肺小动脉本身病变引起肺血管阻力增加所致，且不合并慢性呼吸系统疾病、慢性血栓栓塞性疾病及其他未知因素等导致的肺高血压[10,11]。流行病学调查显示，HFpEF患者是PAH发病的高风险人群[12]。PAH是导致HFpEF病情进展的重要因素，但其早期无明显症状和体征，确诊时病情已较严重。目前，临床上主要通过肺组织活检或心导管检查评价肺血管改变来确定是否并发PAH，但这些检查往往具有滞后性，不能提前预测PAH的发生风险。因此，寻找无创、简单、快捷的手段早期预测HFpEF并发PAH的风险，继而制定针对性干预措施，对提高患者生活质量具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展，miRNA与疾病的关系逐渐成为临床研究的热点。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码小分子RNA，长度为21～25个核苷酸，能够通过与mRNA的3′非翻译区靶向结合从而抑制基因转录和表达，进而介导细胞增殖、分化、凋亡以及器官形成、病毒防御等病理生理过程[13～15]。miR-21属于miRNA家族成员之一，编码基因位于人17号染色体上。有研究报道，在心力衰竭患者心肌成纤维细胞中miR-21表达上调，其表达上调能够通过抑制心肌成纤维细胞凋亡和促进成纤维细胞生长因子2分泌而加速心室肥厚和心肌纤维化，而下调miR-21表达则可改善心室肥厚和心肌纤维化[7]。由此推测，miR-21异常表达可能与HFpEF并发PAH有一定关系，但目前缺少相关证据。

本研究结果发现，PAH-HFpEF组和HFpEF组血浆miR-21水平及LAD、LVMI、PASP均高于对照组，且PAH-HFpEF组上述指标均高于HFpEF组，而三组LVEDD比较差异无统计学意义。结果提示HFpEF患者存在不同程度心室肥厚和心肌纤维化，同时伴有左心房扩大，从而刺激心肌成纤维细胞、血管平滑肌细胞不断分泌和释放miR-21，故HFpEF并发PAH时肺血管受到损伤，从而使心肌细胞中miR-21表达上升。本研究中HFpEF患者血浆miR-21水平与LAD、LVMI均呈正相关关系，表明心肌肥厚能够促进血浆miR-21水平升高，而血浆miR-21水平与PASP呈正相关关系，提示血浆miR-21水平与肺动脉收缩压密切相关。LAD、LVMI与心肌肥厚和心肌纤维化密切相关，心肌纤维化可使左心室充盈压升高，并传导至肺静脉使毛细血管楔压升高导致PAH，也可能是心肌肥厚能够加速肺血管重构而致PAH[16]。本研究进一步采用ROC曲线分析了血浆miR-21对HFpEF并发PAH的诊断效能，结果发现，血浆miR-21诊断HFpEF并发PAH的曲线下面积为0.929，最佳截断值为2.35，此时其诊断敏感性为85%、特异性为93%、准确性为88%。提示miR-21可作为早期诊断HFpEF并发PAH的生物学指标。

综上所述，HFpEF并发PAH患者血浆miR-21水平明显升高，其水平变化与超声心动图检查相关指标具有较好的相关性。血浆miR-21可作为早期诊断HFpEF并发PAH的生物学指标。但由于本研究为单中心的小样本量研究，其结论尚需多中心、前瞻性、队列研究进一步验证。