系统性红斑狼疮的诊断新方法与临床验证*

廖秋燕，汤冬娥，赵 鑫，何慧燕，李琼英，刘富菊，上官美荣，林连成，李林煜龙，戴 勇,3△

1.暨南大学第二临床医学院/广东省深圳市人民医院临床医学研究中心，广东深圳 518020；2.广东省深圳市赛尔生物技术有限公司，广东深圳 518126;3.解放军联勤保障部队第九二四医院中心实验室，广西桂林 541002

系统性红斑狼疮(SLE)是一种全身多个器官和系统均可受累的自身免疫性疾病，以免疫性炎症为突出表现[1-2]，主要受累人群为中青年女性，如不及时治疗可引起肾衰竭等致死性损害，严重危害人类健康，其病因及发病机制至今未明[3]。目前临床上对于SLE的诊断主要依据美国风湿病学会(ACR)1997年推荐的SLE分类标准:患者满足11条标准中的4条或以上，并排除了感染、肿瘤和其他结缔组织病后，可诊断为SLE[1]。此标准为免疫学方法、临床化学及部分病理学方法的汇总，一直沿用至今。但这种诊断方法由于缺乏足够的敏感性及特异性，往往容易造成患者的误诊或漏诊[4]。相关研究表明，SLE患者若及早发现并予以治疗，可更好地控制病情进展[5]。因此，找到具备高敏感性和高特异性的诊断标志物对于提高SLE的诊断准确率非常重要。研究发现，干扰素相关基因(包括IFI44L、IFIT1、MX1、STAT1、USP18、BST2和TRIM22基因[6])在SLE患者的CD4+幼稚T细胞中处于低甲基化水平。之后研究人员使用DNA甲基化芯片技术从大量SLE患者外周血基因中发现IFI44L基因启动子区两个甲基化位点可以作为诊断SLE的高敏感性和特异性的生物学标志物[7]。为了验证IFI44L基因甲基化位点作为SLE标志物在临床诊断中的意义，本研究收集患者外周血标本共136份(SLE确诊患者标本及非SLE患者标本)，对标本进行随机排列并编号处理后，使用SLE基因甲基化检测试剂盒对标本的IFI44L基因甲基化位点进行检测，检测完毕后进行揭盲，对灵敏度、特异度、总符合率和一致性系数Kappa值进行评价，验证该试剂盒检测结果的准确性和有效性，评价IFI44L基因甲基化位点作为SLE标志物在临床诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究收集患者外周血标本共136份，根据ACR推荐的SLE分类标准对患者进行诊断，其中SLE确诊患者标本74份(来源于深圳市风湿病院检验科45份、北京大学深圳医院检验科29份)，非SLE患者标本共62份(来源于深圳市人民医院中心实验室)。136份标本中男50例(年龄20～67岁)，女86例(年龄15～57岁)。

1.2仪器与试剂 SLE基因甲基化检测试剂盒[甲基化特异性高分辨率溶解曲线法(MS-HRM法)]由深圳市赛尔生物技术有限公司提供，批号为20180517。DNA提取试剂盒采购自Thermo Scientific Gene Jet Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit.#ko782，由深圳市赛尔生物技术有限公司提供。其他仪器还包括罗氏lightcycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪、ABI-Q3荧光定量PCR仪、Nanodrop2000核酸蛋白分析仪、恒温水浴箱、旋涡振荡器等。

1.3方法

1.3.1标本编号及盲法处理 将136份外周血标本进行随机排列并编号，新编号与患者的标本号或住院号保持一一对应，以便能够清楚地溯源。

1.3.2DNA提取及MS-HRM法操作 按照Thermo Scientific公司试剂盒说明书进行DNA提取，提取完毕后在Nanodrop2000分析仪上测定DNA含量，所有标本提取完毕后置于-20 ℃保存待用。按照深圳市赛尔生物技术有限公司提供的试剂盒进行操作(MS-HRM法)，使用获得的数据对SLE患者进行诊断。

1.3.3评价方法 研究表明，SLE患者IFI44L基因启动子的两个CpG位点甲基化水平显著性降低[7]。SLE基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM法)的结果判定标准：当患者检测结果显示IFI44L基因CpG位点甲基化水平在0～25%时，即可判定该患者为SLE患者。对136份标本全部检测完毕后，根据患者的标本号或住院号对检测标本进行揭盲，将检测结果与临床确诊结果进行对比，评价检测方法的灵敏度、特异度、总符合率、一致性系数Kappa值，以及进行χ2检验，验证使用该方法的试剂盒在临床检测上的准确性和有效性，评价IFI44L基因甲基化位点作为SLE标志物在临床诊断中的意义。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行分析，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1试剂盒检测结果 经SLE基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM法)检测后，136例患者中有71例为SLE患者，其中男10例，女61例；65例为非SLE患者，其中男40例，女25例。IFI44L基因甲基化水平为0～25%、>25%～50%、>50%～75%的例数分别为71、41、24例。

2.2试剂盒检测结果与临床确诊结果比较 与临床确诊结果对比，试剂盒判定的71例SLE患者中，有2例为非SLE患者；试剂盒判定的65例非SLE患者中有5例为SLE患者。结果显示，试剂盒检测SLE的灵敏度、特异度及总符合率分别为93.24%、96.77%和94.85%，Kappa值为0.896 7。两种方法的检测结果比较，差异无统计学意义(χ2=0.133，P>0.05)。见表1。

表1 IFI44L基因甲基化检测结果与临床确诊结果对比(n)

3 讨 论

SLE是一种自身免疫介导的弥漫性结缔组织病，免疫性炎症是其主要表现。SLE发病以15～45岁的育龄期女性为主，目前世界范围内SLE的发病率为40/10万～70/10万，男女比例为1∶9。而我国的SLE患者目前预计超过100万，女性患者患病率约为113/10万，且我国SLE患病率有逐年递增的趋势[8]。SLE以患者免疫系统的异常活化和自身抗体异常增多为特征，患者全身多个部位及系统均可受累，如皮肤、关节、肾脏、心脏、肺、大脑、血液系统、神经系统等[9-10]，若不及时治疗可导致多种致死性损害，如肾衰竭等。研究表明，SLE患者合并恶性肿瘤的发生率增加，非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、乳腺癌及支气管肺癌是常见的恶性肿瘤类型[11-12]，由此可见SLE严重危害人类健康。IFI44L基因是Ⅰ型干扰素刺激性应答基因(ISG)，属于FIF44家族[13]。相关研究表明，IFI44L蛋白在抗病毒及癌症治疗中均有着重要的作用[14]。

本研究以IFI44L基因甲基化位点作为SLE的基因诊断标志物，对136例患者的外周血进行IFI44L基因甲基化水平检测，以判定SLE患者，判定结果与临床确诊结果的总符合率为94.85%，灵敏度达93.24%，特异度达96.77%，Kappa值为0.896 7，一致性良好。这与相关研究结果基本符合[7]。本研究两种方法的检测结果差异无统计学意义(χ2=0.133，P>0.05)，说明IFI44L基因甲基化位点可作为SLE的基因诊断标志物。

其中，74例SLE患者的标本中有69份与临床确诊结果相符合，有5例SLE患者被判定为非SLE，经确认这5例标本的甲基化水平均在25%～50%，经过揭盲，5例标本均为SLE缓解期的标本，这一结果与相关研究结果一致[7]：SLE患者IFI44L基因甲基化水平显著降低，而SLE缓解期患者IFI44L基因甲基化水平显著升高。这一结果从侧面说明SLE患者在治疗过程中还可以通过检测IFI44L基因甲基化水平来监测SLE病情变化。62例非SLE患者的标本中，有60例标本检测结果与临床确诊结果完全一致，但有2例标本被诊断为SLE，经过揭盲，发现这2例标本均为肺癌患者的标本，且其IFI44L基因甲基化程度都在25%的曲线附近，近乎重叠，按照试剂盒判定标准判定为SLE。相关研究证实，IFI44L在肝癌患者的met/Src信号调节通路中作为一种新型的肿瘤抑制因子，当IFI44L蛋白减少时可导致肝癌细胞的肺转移[15]。因此，虽然该检测方法对2例非SLE患者进行了误判，但也有利于筛选出癌症患者，有利于患者的尽早确诊和治疗。

作为本研究的检测试剂盒，SLE基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM法)对SLE患者判定的准确度高、有效性好，其灵敏度及特异度高于目前市场的同类基因甲基化检测试剂产品(大肠癌septin9基因甲基化检测试剂盒的灵敏度为79%～85%，特异度为90%～93%)，表明该试剂盒作为SLE的诊断试剂盒，已能够满足临床的需求。此外，目前国际上较缺乏SLE的基因诊断方法，本试剂为国际上较早使用基因甲基化的方法诊断SLE，对于SLE的诊断标准是一种扩展。

综上所述，选取IFI44L基因甲基化位点作为SLE的生物标志物对SLE患者进行诊断是可行的。这是除传统方法外的另一种有效的SLE诊断手段，可辅助判断SLE患者病情变化，并可从表观遗传学角度提供SLE发生的证据。同时SLE基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM法)测试方法简便、准确度高，甚至可以在肾损害发生之前明确SLE的发生，对于疾病的干预有重要的临床应用价值，建议推广使用。

(志谢：在此感谢深圳市风湿病院及北京大学深圳医院，本研究的部分标本获深圳市风湿病院检验科及北京大学深圳医院检验科的支持。)