IBA处理对美国木豆树扦插生根及其生理生化的影响

毕会涛， 王言歌， 申洁梅， 权金娥

(1.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002；2.河南省经济林和林木种苗工作站，河南 郑州 450002)

美国木豆树(catalpabignonioides)俗名南梓木、美国梓木、印第安木豆树等，原产北美洲，是紫葳科(Bignoniaceae)梓属(Catalpa)落叶乔木。在美国东部和南部各州以及加拿大东部均有分布；近年来中国内蒙古、辽宁等省有引种栽培[1]。美国木豆树在北美主要用于街道和庭院绿化，其春可观叶，夏可观花，秋可观果，且树冠宽阔，常用作开阔地带上风处的防风屏障树[2]。在魏左平等[3]研究的260种园林植物中，美国木豆树被评为一级园林植物树种，可见其景观绿化效果最佳，是珍贵的园林绿化树种。目前美国木豆树繁殖技术研究报道较少，但作为紫葳科梓树属的同属植物，其繁殖技术等研究较多，如盛淑艳等[4]对黄金树育苗技术做了简单介绍；桂炳中等[5]对黄金树的播种繁殖和扦插繁殖及其栽培管理进行了初步研究。为了大力推广美国木豆树在中国的引种栽培，需要大量快速地繁育苗木。然而在研究过程中却发现，美国木豆树播种繁殖困难，其种子休眠特性，及生根发芽缓慢严重制约了其快速繁殖[3]；目前，国内种子资源有限，制约了其大面积生产与应用。扦插繁殖是目前最为经济有效的繁殖手段，且可保持母本优良性状、提前开花结实、加快苗木繁殖推广[6]。因此，开展美国木豆树扦插快繁技术，有利于其种苗产业化发展与推广应用。目前，国内外有关美国木豆树嫩枝扦插技术的系统性研究尚未开展。自外源激素吲哚丁酸(IBA)被报道可促进植物不定根的形成，甚至比IAA更有效以来，IBA已广泛应用于植物扦插繁殖研究[7]。多数研究结果表明，经IBA处理的植物插穗，生根率高于未经处理的插穗[8-9]。白磊等[10]研究发现，外源生长素处理可加速插穗根原基形成。当外源激素使用量过少或过多，会打破内源激素的平衡，使不同激素间协同作用受到干扰，不利于插穗生根[8]。因此，本研究以美国木豆树当年生嫩枝插穗为试验材料，通过研究不同IBA质量浓度处理对其插穗生根指标的影响，筛选适宜美国木豆树嫩枝插穗生根的最佳IBA质量浓度处理，通过插穗生根过程中生理指标的变化，揭示其扦插繁殖生根机理，不仅为美国木豆树的扦插繁殖提供理论依据，也为大量快速地繁育苗木提供实践参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料、处理和样品采集

以河南农业大学试验区3 a生美国木豆树为母树选取当年6月中旬嫩枝枝条为试材。在扦插当天选取无病害、强健母树，在其枝干上剪取当年春季新萌发粗细和长短一致，直径为0.6～0.8 cm的枝条，枝条修剪成长为12～15 cm插穗。插穗上端平剪，下端斜修剪成距芽约1 cm处呈45°的切口。

采用随机区组设计，共分为4个处理组，每组3次重复，每重复80根插穗。将修剪好的插穗每80根为一捆，用质量分数为50%的多菌灵可湿性粉剂800倍液浸泡基部1 min，再分别利用IBA质量浓度为0(清水对照，CK)、500 mg·L-1(T1)、1 000 mg·L-1(T2)和1 500 mg·L-1(T3)的溶液浸泡插穗基部1 h。插穗扦插后，在扦插0、7、15、25 和35 d分别采取不同处理的插穗，每个处理每次随机取6根，用以观察记录其形态指标变化；其次，随机再取插穗6根，冲洗泥沙，擦干水分，尽快剥取插穗基部2 cm内的皮层，剪碎后用锡箔纸包裹投入液氮，然后，带回实验室转入超低温冰箱-80 ℃保存备用，后续用以测定氧化酶活性和内源激素含量。

1.2 扦插及插后管理

嫩枝扦插试验利用全光照喷雾扦插育苗技术。周围用砖围成长5 m、宽4 m、深0.5 m扦插池，扦插池内基质为(m(纯净细河沙)∶m(蛭石)∶m(珍珠岩)=3∶1∶1)；距扦插池上方1.5 m处安装自动喷雾系统，自动喷雾系统上方布设遮阴网。扦插前1周，用质量分数为50%的多菌灵可湿性粉剂800倍液均匀喷洒扦插池和基质，同时晾晒基质。扦插当天用水浇透苗床基质，扦插的深度为7～8 cm，密度为40根·m-2。扦插后，每天8：00—18：00进行水分控制，喷水间隔和时间采用北京林科院制作的定时器控制，为了保持叶片水分，定时器每隔30 min喷雾1次；夏季高温天气为了防止叶片缺水萎焉脱落，每天在11：00—16：00用遮阳网对插穗进行遮阴。空气湿度保持在70%左右，扦插基质湿度保持在50%左右，以手握成团松手即散为宜。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生根性状 为了准确观察插穗基部形态学变化，从扦插第5 天后，每隔1 d随机选取每组插穗3根进行观察和记录。第40 天调查扦插池内所有插穗生根情况，先统计生根率；再利用爱普生Epson Perfection 4990 photo根系分析仪(日本，长野)测定每组插穗根的直径、最长根长及生根量。

生根率/%=(生根插穗数/供试插穗总数)×100%

(1)

根直径/mm=根直径之和/总根数

(2)

最长根长/cm=根长之和/总根数

(3)

生根量=生根量之和/总根数

(4)

1.3.2 氧化酶活性和内源激素指标测定 过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚染色法，单位:μg·g-1·min-1；多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚法，单位:U·g-1；吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性测定采用比色法[11]，单位:μg·g-1·min-1；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT光化还原法[12]，单位:U·g-1；每个样品重复3次。植物内源激素提取参照何崇单等[13]的方法，通过酶标仪(美国、BioTek公司、ELx800TM)测定生根相关的内源激素吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和细胞分裂素(ZR)含量，激素测定方法采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)，单位ng·g-1；每个样品重复3次。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2017软件来处理，采用SPSS 24.0进行方差分析和相关性分析，Origin 8 软件作图。其中，采用Duncan法进行多重比较，Mean±SE形式表示试验结果。

2 结果与分析

2.1 美国木豆树插穗生根过程中基部形态观察及分期

对美国木豆树插穗生根形态学观测结果表明，扦插第 7 天后，插穗基部开始产生乳白色愈伤组织(图1-A)；10～15 d愈伤组织逐渐变大，且变为浅橘黄色；16～25 d愈伤组织开始突起，即根原基期 (图1-B)；26～30 d愈伤组织内根原基继续分化，一些插穗基部皮层长出不定根(图1-C)；31～40 d插穗基部伸出不定根且根系不断伸长 (图1-D)。因此，可把美国木豆树嫩枝插穗生根过程划分为4个阶段：扦插后第1天为初始期，2～15 d为愈伤期，16～25 d为根原基期，26～40 d为不定根产生与伸长期。

A:愈伤组织; B:根原基形成; C:不定根产生; D:不定根伸长

2.2 不同质量浓度IBA处理对插穗生根状况的影响

不同质量浓度IBA处理对插穗生根性状的影响见表1，不同质量浓度IBA处理对插穗生根率影响达到极显著水平(P<0.01)。质量浓度为1 000 mg·L-1的T2处理生根率最高，生根率达到84.00%；其次为T3处理；CK的生根率最低为8.00%；最高浓度T3处理的生根率为60.00%。可见，插穗浓度过高或者过低都不利于美国木豆树插穗生根。T2和T3处理的根直径、生根量和最长根长均显著高于T1处理与CK(P<0.05)，T1与CK的根直径、生根量和最长根长差异不显著。总的趋势为，IBA处理质量浓度高的略高于处理质量浓度低的，T2处理生根率、生根量均显著高于其他处理。分析结果表明，质量浓度为1 000 mg·L-1的T2处理对美国木豆树嫩枝插穗生根的影响最好。

表1 不同质量浓度IBA对插穗生根性状的统计分析Table 1 Statistical analysis of rooting characters of cutting with different mass concentration IBA

注：表中数值为平均值±标准误；在同一列中标有不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著。大写字母(A,B,C,D)为P<0.01，小写字母(a,b,c,d)为0.01

Note: The values in the table are mean ± standard error; If there are different letters marked in the same column, the different is significant, if there are the same letters, the difference is not significant. Capital letters (A, B, C, D) meanP<0.01, while lowercase letters mean 0.01

2.3 不同质量浓度IBA处理对插穗生根过程中氧化酶活性的影响

与CK相比，经不同IBA质量浓度处理的插穗，生根阶段POD活性均随着扦插时间的延长而明显升高(图2-A)。T1、T2和T3处理的POD活性在不定根伸长期最高，分别为2 673.19、2 763.31和2 378.60 ug·g-1·min-1。不定根伸长期，处理组的POD活性平均值比扦插初始期增加了约7倍。从整体变化幅度上看，在生根发育过程中T2处理POD酶活性明显高于其他处理。因此，用1 000 mg·L-1IBA溶液处理插穗能明显提高POD活性。

不同IBA质量浓度处理的美国木豆树插穗PPO活性并非随IBA质量浓度增加而增加(图2-B)。相比其他处理，T2处理在愈伤期、根原基期和不定根产生期的PPO活性均最高。这表明，用1 000 mg·L-1IBA溶液处理插穗能提高PPO活性。在不定根伸长期，所有处理的PPO酶活性最高，这表明PPO活性对根伸长有明显促进作用。

在初始期、愈伤期和根原基期IBA处理的插穗随着扦插时间延长与CK的 IAAO活性差异越大。不定根伸长期IAAO活性最低。除愈伤期外，T1处理的IAAO活性均最高。数据表明，IBA诱导条件下，IAAO活性对根原基形成影响最大，且较低浓度500 mg·L-1的效果最好(图2-C)。

由图2-D可知，扦插生根过程中，美国木豆树插穗SOD酶活性呈先上升后下降的趋势。处理组在愈伤期达最大值，之后明显下降，不定根产生期，T2处理明显升高，说明SOD酶对愈伤组织诱导和不定根产生有促进作用。从整体变化幅度上看，IBA处理的插穗SOD活性明显高于对照；除根原基期外，1 000 mg·L-1IBA处理插穗能明显提高SOD活性，说明IBA对插穗扦插生根有促进作用；不同处理插穗SOD活性并非随IBA质量浓度增加而增加。

2.4 不同质量浓度IBA处理对插穗生根过程中激素含量的影响

与CK相比，在插穗整个生根过程中除根原基期之外，T2和T3处理的IAA含量均显著高于CK和T1处理；在初始期和不定根伸长期，T2处理和T3处理的IAA含量相差不大，其他3个时期，T2和T3处理的IAA含量差异显著(图3-A)。整体上看，IBA处理的IAA含量均高于CK；在不定根产生期，各处理的IAA含量较高。这些结果表明，IBA可促进插穗IAA含量增加，尤其是利用T2和T3来处理插穗能明显促进插穗IAA含量增加。

CK在整个生根过程中ABA含量偏高，并且插穗生根过程中ABA含量处于平稳状态；与CK相比，T2处理在整个生根过程中ABA含量最低；在愈伤期、根原基期和不定根产生期，IBA处理的ABA含量均显著低于CK(图3-B)。这些结果表明，外源激素IBA处理插穗后明显抑制ABA含量增加，ABA含量的降低有利于插穗不定根产生，尤其浓度为1 000 mg·L-1IBA处理后影响插穗生根最明显。

CK在整个生根过程中GA3含量偏低，其中在愈伤期、根原基期和不定根伸长期GA3含量最低(图3-C)；在愈伤期、不定根产生和不定根伸长期T3处理的GA3含量最高；从整体上看，IBA处理的GA3含量明显高于CK，并且随着IBA质量浓度的增加GA3含量也增加。这些结果表明，IBA促进插穗GA3含量增加，并呈现浓度的依赖性。

与CK相比，在整个生根过程中IBA处理的ZR含量较低，并且随着IBA质量浓度的增加ZR含量随之降低(图3-D)。在初始期和愈伤期，T2和T3的ZR含量均显著高于CK；然而，根原基期、不定根产生与伸长期，处理组的ZR含量均显著低于CK，尤其是在不定根产生期。结果表明，IBA处理插穗后根原基产生前期促进ZR含量升高，根原基产生后期插穗ZR含量降低，外源IBA质量浓度对插穗ZR含量影响不明显。

图2 IBA处理对插穗生根过程中氧化酶活性的影响

图3 IBA处理对插穗生根过程中激素含量的影响

3 讨论

3.1 不同质量浓度IBA处理对美国木豆树插穗生根率的影响

难生根树种促进生根研究是一个重要研究课题，目前许多难生根树种利用不同外源激素可显著促进其生根[15]。本研究中清水(CK)处理结果表明,只有8.0%的当年生嫩枝插穗生根，表明美国木豆树为难生根的树种。有研究报道，相比其他植物外源激素,IBA诱导难生根树种生根效果最明显，如姜宗庆等[16]研究不同植物生长调节剂(IBA、NAA、ABT)对银杏扦插生根的影响，王小玲等[11]利用外源激素(IBA、GGR6)处理四倍体刺槐硬枝插穗，以及蓝金宣等[17]利用不同外源激素(IAA、IBA)处理细子龙插穗。本研究发现,IBA处理能显著提高美国木豆树插穗生根率，其中1 000 mg·L-1IBA处理生根率最高为84.0%，比对照提高10倍多。对IBA处理美国木豆树扦插生根的形态观察，在插穗扦插第7天，IBA处理组提前出现愈伤组织(图1-A)，而对照组未出现愈伤组织；从插穗生根过程中形态变化结果可以说明，利用外源IBA不仅明显提高了生根率，而且加快不定根提前产生，这一结果与周再知等[18]利用IBA对裸花紫珠扦插生根研究以及王小玲等[11]利用IBA对四倍体刺槐扦插生根研究结果一致。

3.2 不同质量浓度IBA对美国木豆树插穗生根生理生化的影响

3.2.1 IBA对插穗生根相关氧化酶活性的影响 POD是与生根关系非常密切的氧化酶，能够调节体内IAA水平，在根的形成过程中影响着根原始体的启动与不定根的形成[19]。宋金耀等[20]认为，POD活性峰值的出现往往伴随着根原基分化和不定根的形成。插穗扦插生根过程中POD能够促进木质素的合成以及木栓层的形成，加强细胞壁刚性，参与抗氧化自由基清除[21]。本试验中，美国木豆树插穗扦插生根过程中处理组POD活性一直处于升高的趋势；由此可见，POD活性的升高不但有利于美国木豆树插穗根原基分化和不定根产生，也增强新生根系的细胞壁强度，降低了插穗在离体环境中的胁迫程度。相比IBA处理组，对照组POD活性偏低，说明外源IBA可提高美国木豆树插穗POD活性，促进不定根形成。

PPO 活性与植物不定根的形成联系密切，酚类物质在不定根形成和发育过程中起到了非常重要的作用。有研究认为，PPO能够催化酚类物质和IAA 形成“IAA-酚酸复合物”的生根辅助因子，从而促进不定根的形成[22]。在葡萄、山茶的不定根诱导期，PPO活性有上升趋势[23-24]。本试验中，插穗扦插愈伤期、根原基和不定根产生期PPO活性高于初始期，可能原因是大量生根阶段高活性PPO有助于生根；且IBA处理组PPO酶活性高于对照组，说明外源IBA能提高PPO活性，促进美国木豆树插穗愈伤组织的产生以及不定根的形成。这一结果与王小玲等[11]用IBA处理四倍体刺槐插穗引起PPO活性大幅上升，促进大量不定根产生结果一致。PPO 活性在美国木豆树插穗不定根伸长期显著提高，原因可能是插穗生根后体内生根促进因子“IAA-酚酸复合物”相继增多，有利于不定根生长和伸长[25]。

IAAO通常被认为是POD的同源异构体，其主要功能是氧化脱羧IAA，在酚类化合物存在时，IAA氧化产物可促进根原基的形成[26]。本试验中，美国木豆树插穗扦插根原基期的IAAO活性高于其他时期，说明IAAO活性能有效促进插穗根原基的分化和形成。HUSEN[27]发现，外源激素处理的插穗IAAO活性显著高于未经处理插穗。在整个美国木豆树插穗扦插生根过程中，处理较对照IAAO酶活性高，说明外源IBA提高IAAO活性，促进插穗不定根的产生。这一结果与王小玲等[11]在IBA处理四倍体刺槐茎段根原基分化时，IAAO活性显著增高的结论一致。

有研究认为，SOD能有效清除植物在逆境中形成的自由基和活性氧，是保护酶系统的重要组成部分，影响着植物的发育过程，与植物生根密切相关[28]。在紫薇[29]、银杏[16]和东京野茉莉[30]的生根发育过程中，处理和对照SOD活性呈先上升后降低的趋势。本试验中，插穗扦插生根过程中SOD活性愈伤期最高，之后降低。不定根产生期，T2处理显著升高，之后又降低，说明SOD活性有助于愈伤组织诱导和不定根产生，SOD活性在愈伤组织和不定根产生期，基部的营养物质和超氧阴离子大量积累，SOD活性增强，且在插穗生根过程中，IBA处理组SOD酶活性高于对照，表明IBA处理可以提高SOD活性，提高插穗防御能力，促进美国木豆树插穗愈伤组织的产生以及不定根的形成。

3.2.2 IBA对插穗生根相关内源激素的影响 内源激素水平的高低与插穗生根能力密切相关，外源激素可以通过调节内源激素水平，间接影响不定根形成及根系的形成和发育[31]。徐继忠等[32]研究表明，桃树硬枝插穗根原基形成过程中，IAA含量逐渐升高，在不定根突出表皮前，IAA含量达到高峰。詹亚光等[33]的白桦试验表明，IAA含量高峰与根原基出现的高峰一致，较高含量的 IAA对根原基的发生有诱导作用；本试验中，美国木豆树插穗扦插过程中内源IAA变化的趋势也支持了以上研究结论。周再知等[18]认为，对裸花紫珠 IAA 升高的原因可能是使用外源生长激素IBA处理，促进了不定根的形成。在美国木豆树扦插初始期、愈伤期、不定根产生期和伸长期，处理组T2和T3插穗内源IAA始终高于对照，这可能是IBA影响了内源IAA的合成，或是IBA影响了与内源IAA合成相关的一些氧化酶活性的缘故。

ABA一般被认为是扦插生根的抑制剂，抑制细胞分裂。本研究结果表明，美国木豆树插穗扦插愈伤期、根原基期，内源ABA含量降低，这与张锦春等[34]研究沙生柽柳插穗扦插生根过程中内源ABA变化结果一致，说明较低的内源ABA含量有利于生根。美国木豆树扦插生根过程中，IBA处理组内源ABA含量普遍低于对照组，可能是由于IBA影响内源ABA的合成，致使内源ABA含量下降，从而提高了生根力，这与多数研究结果类似[32-35]。

GA的作用主要是促进植物茎的伸长和细胞分裂等，对插穗生根的影响比较复杂，一些研究支持GA抑制插穗不定根的形成[36]，但也有研究认为，GA可促进插穗不定根的形成。NANDA等[37]研究认为，GA可以显著诱导牵牛木质化插穗根原基分化及不定根的形成，促进插穗生根。潘瑞炽等[38]认为，GA在较高质量浓度时抑制不定根的形成，但这种抑制作用是局部的。本试验扦插生根过程中，GA含量处于缓慢降低趋势，说明较低质量浓度GA含量有利于插穗生根。在整个生根过程中，IBA处理GA含量整体高于对照；表明IBA处理加速了插穗GA的合成，对美国木豆树的扦插生根有利。

整个生根过程中，美国木豆树ZR含量处于缓慢降低趋势，说明较高水平的ZR有利于插穗愈伤组织的诱导、较低质量浓度ZR含量有利于插穗生根，这一结论与王小玲等[11]研究四倍体刺槐扦插过程中ZR降低则有利于不定根形成结果一致。相比对照组，美国木豆树插穗扦插生根过程中IBA处理组ZR含量动态变化显著，且在根原基期之前，T2和T3处理组插穗ZR含量高于对照，原因可能是IBA加速了插穗内源ZR的合成，对美国木豆树的扦插生根有利，与周再知等[17]裸花紫珠插穗经IBA处理后引起插穗ZR含量下降的结论相反。影响美国木豆树扦插生根的因素有诸多方面，还有其他影响生根发育的因素还有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，当插穗IBA质量浓度为1 000 mg·L-1时，插穗的生根率(84.0%)、生根量(22.0个)和根直径(2.19 mm)等生根性状最佳，CK插穗生根能力最差。从整体上看，IBA处理的插穗氧化酶POD、PPO、IAAO和SOD活性明显高于CK，在愈伤期、根原基期和不定根产生期，T2处理的POD、PPO活性显著高于其他处理。处理组T2和T3插穗内源激素IAA和GA3含量明显高于CK，ABA含量明显低于CK，ZR含量根原基期前整体高于CK，根原基期后整体低于CK。由此可见， IBA可显著影响与生根相关的氧化酶活性、内源激素含量，促进不定根形成。植物插穗生根过程的机制较为复杂，影响美国木豆树插穗生根的生理生化因素也是多方面的，故深入研究其扦插繁殖的生根机制仍需要大量实践探索，以及通过分子生物学技术手段进一步探索研究。