超低温冷冻保存对西伯利亚鲟精子酶活性的影响

周 洲，李世凯，赵 飞，陈飞雄，孔 杰

(贵州省农业科学院 水产研究所，贵州 贵阳 550025)

西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)属鲟形目、鲟科、鲟属，生长速度快、鱼籽酱品质高，是目前我国鲟鱼类人工养殖的主要品种之一。贵州自2012年实现西伯利亚鲟全人工繁育以来，目前养殖面积已超过8万m2，优质苗种供应不足已经成为限制贵州鲟鱼规模化养殖的瓶颈。精子超低温冷冻保存技术可实现对精子的长期保存，对鱼类种质资源保存和优良品种的选育具有决定性的影响，目前已在日本鲟、中华鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟和达氏鲟[1-5]等鲟鱼类中有较多报道，但冻存激活后精子的活力和受精率难达到鲜精的水平。酶活性检测法是评价精子超低温冷冻保存效果的一种常用检测办法，目前已应用于大黄鱼、花鲈、长鳍篮子鱼及俄罗斯鲟等鱼类精子超低温冷冻保存研究中[6-9]。因此，试验通过分析超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子酶活性的变化，检测鲜精和冻精质量，探讨超低温冷冻保存对精子酶活性的影响，以期对西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存体系优化及冷冻精子保存效果提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 西伯利亚鲟精液样本的采集和制备

1.1.1 样本采集 亲本均来自贵州省水产研究所惠水养殖基地。于2019年4月在西伯利亚鲟繁殖期间，选体长(1.42±0.25)m、体重(18.6±3.5)kg的性腺发育成熟的雄鱼5尾，进行人工催产取精。取精时，用干净的干毛巾擦去鲟鱼体表和生殖孔周围的水分及污物，将生理盐水洗净的塑料软管轻轻插入生殖孔，用手轻轻挤压其腹部使精液自然经导管流入干净干燥的50 mL离心管中，并通过计算机辅助精子分析系统快速检测精子活力情况，选取精子活力大于90%的精子样本用于试验。

1.1.2 样本制备 将采集的精液分为2组，即鲜精组(对照)和冻精组。选取体积分数15%的二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂，以KCl 0.25 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L、Tris-HCL 10 mmol/L(pH 8.5)作为稀释液[10]，将精液以1∶1的体积比加入配制好的抗冻保护液，混匀平衡后，将装有精液的冷冻管置于液面以上6 cm处平衡2 min，之后在液面以上2 cm处平衡2 min，最后在平行于液氮面平衡2 min后投入液氮中。精子解冻时将冻存管从液氮中取出，立即放入备好的恒温为37℃的水浴锅中，轻轻摇晃至冻存管中没有小絮状冰块为止。解冻后的精子经计算机辅助精子分析系统(CASA)分析精子活力在30%左右，将2个处理组的样本在3 000 r/min、4℃条件下离心15 min，去除精浆后，向白色精子沉淀中加入0.9%生理盐水洗涤，同样条件下离心、洗涤2次，最后将精子置于-20℃冷冻保存。待需要检测时，将样本放置于4℃条件下缓慢融化，继续在3 000 r/min、4℃条件下离心 15 min，取上清液中间位置用于西伯利亚鲟精子内相关酶活性的检测。

1.2 酶活性的检测

采用南京建成生物工程研究所的酶活检测试剂盒测定西伯利亚鲟精子内总ATP酶(Totoal ATPase)、谷胱甘肽还原酶(GR)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性。

1.3 数据处理

每组试验设5个重复，数据用平均值±标准差表示，利用SPSS 19.0对西伯利亚鲟精子冷冻前后各种酶活性的差异显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子能量代谢的酶活性

从图 1可知，西伯利亚鲟新鲜精子中总ATP酶、CK酶、LDH酶和SDH酶的活性均是新鲜精子高于超低温冷冻保存的精子，其中，超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子总ATP酶的平均活力由(18.77±1.23)U/mL降至(16.32±0.87)U/mL，CK酶由(6.64±0.58)U/mL降至(5.27±0.23)U/mL，LDH酶由(6 695.78±123.47)U/L降至(4 388.32±93.28)U/L，SDH酶由(24.91±1.63)U/mL降至(17.45±0.94)U/L。超低温冷冻前后总ATP酶活性差异不显著性(P>0.05)，CK酶、LDH酶和SDH酶的活性差异达显著水平(P<0.05)。

2.2 超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子的抗氧化酶活性

从图2可知，超低温冷冻后西伯利亚鲟精子中SOD酶和CAT酶活性均低于新鲜精子，差异达显著水平(P<0.05)；GR酶活性则高于新鲜精子，差异达显著水平(P<0.05)。其中，超低温冷冻前后SOD酶平均活力由(61.99±4.15)U/mL降至(46.38±2.54)U/mL，CAT酶由(112.33±6.38)U/mL降至(67.58±3.87)U/mL，GR酶由(23.36±1.69)U/mL增至(94.61±4.13)U/mL。

注：同一图中不同小写字母表示差异达5%显著水平。
Note:Different lowercase lellers in the same graph indicate significance of difference atP<0.05 level.
图1西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存和新鲜精子中能量代谢的酶活性
Fig.1 Total enzyme activity of energy metabolism of cryopreservation and fresh spermatozoa inA.baerii

3 结论与讨论

鱼类精子内的能量代谢酶与精子的活力有密切的关系，目前精子内常见的能量代谢酶有总ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等，其酶活性可以用来分析精子质量[11-13]。ATP酶可将其酶解释放的能量用于生命体各项生命活动，精子开展各种需能活动都需要ATP酶以获得能量，因此可用ATP酶活性判断精子是否受到损伤[14]。研究发现，线粒体特征酶SOD活性可判断超低温冷冻前后精子内线粒体功能是否受损[12,15]。LDH酶是精子能量代谢过程中的一种糖酵解酶，可通过呼吸作用给精子提供能量，因此该酶的活性可以作为衡量精子质量的一个生化指标[16]。CK酶通常存在于各类细胞浆和线粒体中，是与细胞内能量运转和 ATP酶再生有直接关系的重要激酶[17]。黄晓荣等对大黄鱼精子的研究表明，经过超低温冷冻保存后，大黄鱼精子中总 ATP酶、CK酶、SDH酶和 LDH酶的活性均显著低于鲜精。徐滨等[18]研究表明，超低温冷冻后俄罗斯鲟精子的总 ATP酶、SDH酶、LDH酶和CK酶的平均活性均下降。国外学者研究超低温冷冻保存对虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)精子中能量代谢酶酶活性的影响发现，超低温冷冻后精子中LDH酶、CK酶及总ATP酶的活性均呈显著降低趋势[19]。笔者等研究也发现，超低温冷冻保存后，冻精中的总ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等能量代谢相关酶活性均降低，其中SDH酶、CK酶及 LDH酶活性显著降低，表明超低温冷冻保存对鲟鱼精子相关生命活动产生了影响，从而降低了鲟鱼精子的受精能力。一方面可能是由于超低温冷冻对精子能量代谢相关酶的结构造成一定的伤害，另一方面也可能是超低温冷冻保存及解冻使精子受到机械损伤，从而导致精子内的相关酶从细胞膜中溢出。在长鳍篮子鱼精子、日本鳗鲡[20]等鱼类超低温冷冻保存研究报道都得出一致的结论。同时，西伯利亚鲟冻精中总ATP酶未出现显著降低，也反映了试验采用的西伯利亚鲟精子冷冻保存剂具有较好的保护作用，可以用于长期超低温冷冻保存西伯利亚鲟精子。

氧化酶活性的变化可以反映细胞在不同外界环境下的生理状态，是用来判断其是否受到损伤的重要生理指标[8,21]。相关研究报道[9,22]均表明，鱼类精子抗氧化酶SOD及CAT都与精子的活力具有密切的关系。GR酶是一种黄素酶，其在缓解因冷胁迫所产生的活性氧危害也具有重要的作用[23]。国内学者研究超低温冷冻保存对中国花鲈、长鳍篮子鱼、俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedti)以及日本鳗鲡[20]等鱼类精子酶活性的影响发现，冻存后精子内的抗氧化酶呈现不同的变化，其中精子内SOD及CAT酶活性显著下降，而精子内GR酶活性则显著上升。笔者等的研究结果表明，经超低温冷冻保存后，西伯利亚鲟精子的GR酶活性显著高于鲜精，SOD酶、CAT酶活性均显著低于鲜精，与上述研究报道相一致。SOD酶和CAT酶活性显著降低，表明超低温冷冻对西伯利亚鲟精子细胞内的抗氧化系统造成损伤，从而不能及时清除氧化还原循环产生的大量活性氧，进而造成对精子的一系列氧化损伤，从而导致精子受精能力降低。同时，GR酶的升高又验证了其活性可以保护精子免受外界冷冻胁迫中发挥重要作用。但目前有关GR酶在鱼类精子超低温冷冻保存中如何发挥作用的机制原理尚未见研究报道。

鱼类精子超低温冷冻保存技术对物种遗传种质资源保护及苗种生产都具有重要价值，贵州省水产研究所实现了对西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存技术的突破，但冻存激活后精子的活力和受精率总难达到鲜精的水平。笔者等研究对超低温冷冻前后西伯利亚鲟精子总ATP酶、GR酶、CK酶、LDH酶、SDH酶、CAT酶及SOD酶等7种酶活性进行研究，其中冻精中总ATP酶、SDH酶、CK酶和 LDH酶等4种能量代谢相关酶，SOD酶和CAT酶等2种抗氧化酶活性均有所降低，这在一定程度上解释了冻精的受精能力显著低于鲜精。因此，在开展鱼类精子超低温冷冻保存条件摸索过程中，可以通过比较冻精中相关酶活性的高低判断冻精受精能力的大小，从而指导寻找鱼类精子超低温冷冻保存最优的稀释液和抗冻剂。