酒用糯高粱EMS突变体库构建及突变体筛选

丁延庆　曹宁　周棱波　程斌　高旭　汪灿　邹桂花　张立异

摘要：【目的】利用甲基磺酸乙酯（EMS）構建酒用糯高粱突变体库，并筛选出田间表型性状明显突变的株系，为糯高粱遗传改良、新品种选育及基因功能研究提供丰富的基础材料。【方法】采用0.4% EMS对糯高粱品种红缨子进行诱变处理，M1代单株收获，并对M2代突变群体开展全生育期的田间表型性状鉴定，筛选出性状明显突变的株系。【结果】经EMS诱变处理后红缨子M1代突变群体田间存活率降至31.9%，且出现了多种性状变异，如叶片白（黄）化、叶片畸形、穗畸形、植株矮化和不育等性状，共获得M1代突变株系1020个。在M2代突变群体中发现86个突变株系，突变频率为8.43%。其中，叶色（白化、黄化、芯叶白化、浅绿色、白绿条纹、黄绿条纹）突变株系42个、叶型（畸形叶、卷曲叶和直立叶）突变株系8个、穗型（畸形、小穗和穗缺失）突变株系10个、生育期（早熟和晚熟）突变株系5个、蜡质（蜡质缺失）突变株系4个、感病性（易感病）突变株系4个、育性（完全不育和半不育）突变株系5个及株高（高杆和矮杆）突变株系8个。【结论】构建的酒用糯高粱EMS突变体库表型变异丰富，可用于高粱功能基因组学研究和酒用糯高粱育种。

关键词： 酒用糯高粱;甲基磺酸乙酯（EMS）;突变体库;构建;表型鉴定;筛选

中图分类号： S532                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2884-08

Abstract：【Objective】A waxy sorghum mutant library was constructed by treatment with the chemical agent ethyl methane sulfonate（EMS），and the lines with obvious trait mutations in field were selected，it provided basic materials for genetic improvement，breeding of new variety，and exploring gene functions of waxy sorghum. 【Method】In this study，Hongyingzi，a waxy sorghum cultivar，was mutated by 0.4% EMS. Each M1 mutant was harvested separately. The phenotype of the M2 mutant population was identified at all-growth stage，and the lines with obvious trait mutations were selected. 【Result】After EMS treatment，the field survival rate of M1 mutant population decreased to 31.9%. Differences were observed between M1 mutant and wild type in phenotypic traits（such as leaf albino，leaf deformity，panicle deformity，plant dwarf and sterility）， and a mutant library containing 1020 M1 lines was obtained.  In M2 mutation population， compared to the wild type，a total of 86 individuals had visible phenotypic variation with 8.43% mutation rate. It included phenotypic mutations of 42 leaf color mutant lines（leaf albino，leaf deformity，core leaf albino，light green，white-green stripes and yellow-green stripes），8 leaf type mutant lines（deformed leaf，curled leaf and erect leaf），10 panicle mutant lines（deformed panicle，small panicle and panicle deletion）， 5 growth stage mutant lines （early ripening and late ripening），4 wax content mutant lines（wax deficiency），4 disease resistance mutant lines（disease susceptible），5 fertility mutant lines（sterility and semi-sterility） and 8 plant height mutant lines（tall and dwarf）. 【Conclusion】Thus，a Hongyingzi mutant library with rich phenotypic diversities was successfully built，which can provide abundant resources for both sorghum functional genomics research and waxy sorghum breeding in the future.

Key words：waxy sorghum; ethyl methanesulfonate（EMS）; mutant library; construction; phenotypic identification; screening

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31660400）; Science and Technology Plan Project of Guizhou（QKHPTRC〔2018〕5768-01）;Youth Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences（QNKYQNJJ〔2018〕76）; Open Project of Research Center for Crop Molecular Breeding of Zhejiang（2020KFKT-001）

0 引言

【研究意义】高粱[Sorghum bicolor（L.） Moench]是全球主要的禾谷类作物之一，属于C4模式作物，具有光合作用率高、耐高温干旱、耐贫瘠、耐盐碱等优点。高粱栽培种根据用途可分为饲草高粱、扫帚高粱、甜高粱和籽粒高粱等4种类型，其中又将直涟淀粉含量在5%以下的籽粒高粱称为糯高粱（汪灿等，2019）。优质糯高粱是酿造茅台酒和习酒等酱香型白酒的主要原料，对我国区域经济发展发挥重要作用。目前，酱香型酒用糯高粱种植品种较单一，主栽品种出现严重退化，且由于穗型和株型的影响，大部分栽培品种产量难以提高，也不利于实现机械化生产。通过甲基磺酸乙酯（EMS）化学诱变构建表型变异丰富的突变体库，可为高粱功能基因组学研究及酒用糯高粱新品种选育提供丰富的基础资源。【前人研究进展】化学诱变剂能诱发作物农艺性状产生突变，经多年多点的突变体选择和鉴定及杂交和回交，最终选育出优良作物新品种（尚静等，2020）。其中，EMS是目前应用最广泛的化学诱变剂，其原理是通过对作物进行诱变产生点突变和少量的染色体变异，进而达到改良作物特殊性状的目的（Greene et al.，2003），已广泛应用于高粱突变体库的构建，且筛选出一些具有优良性状的突变体材料。目前，高粱EMS突变体库的构建主要利用美国高粱品种BTx623。Xin等（2009）利用0.25% EMS诱变BTx623从而构建含1600个株系的突变体库，并筛选获得42个褐色中脉突变体，其木质素含量较野生型大幅减少，从而提高了高粱茎秆的适口性和消化率。王春语等（2014）研究表明，当EMS浓度为0.2%，诱变时间为20 h时，BTx623产生的突变类型最多，可获得叶型、株型、穗型、育性和生育期等性状突变类型。张会等（2015）从甜高粱能饲一号的EMS诱变群体中筛选获得生物量、半纤维素和可溶性糖含量显著提高的3个突变体材料。Jiao等（2016）利用0.1%～0.3% EMS诱变BTx623从而构建含6400个M4株系的突变体库，筛选到486个包括直立叶、褐色中脉、早熟、穗粒数增加和抗倒伏等性状的优良突变株系。Addo-Quaye等（2018）采用0.1%～0.3% EMS诱变BTx623从而构建含12000个株系的突变体库，通过对其中586个突变株系进行深度重测序，快速确定大量真实的SNP变异类型，结合后期的表型鉴定结果，可有效避免假阳性的出现。此外，含有丰富等位基因变异的EMS突变体库是基因遗传功能分析的理想资源库。运用定向诱导基因组局部突变（TILLING）技术，Xin等（2008）从1600株高粱EMS诱变群体中鉴定出2个咖啡酸甲基转移酶基因突变材料;Chen等（2018b）鉴定出1个由于SbNAB1基因突变导致的分蘖数增多、株高降低和腋芽生出的EMS突变体;Jiao等（2018a，2018b）对1个穗粒数显著增加的EMS突变体进行遗传分析，结果发现该表型的改变是由转录因子MSD1突变导致;Li等（2018）通过图位克隆确定高粱脆秆EMS突变体中的突变基因SbBC1，该基因中1个碱基的突变导致突变体茎秆纤维素含量降低，木质素含量增加，从而提高了抗倒伏能力。【本研究切入点】目前高粱EMS突变体库构建所采用的品种较单一。红缨子是贵州茅台酒专用的酿造品种，具有支链淀粉含量高、单宁含量较高、籽粒硬度大和种皮厚等符合茅台酒酿造工艺要求的一系列特点，且作为贵州酒用糯高粱的主栽品种，贵州大部分酒用糯高粱与其具有较近的亲缘关系，是我国南方具有代表性的高粱品种之一。经过长期的自然和人工选择，贵州酒用糯高粱与其他地区（非洲、美国和中国北方）的高粱品种相比在株型和穗型等农艺性状上具有明显的遗传学差异（肖松等，2016;丁延庆等，2019）。但目前鲜见有关红缨子及与其亲缘关系较近的酒用糯高粱品种EMS突变体库构建及突变体筛选的研究报道。【拟解决的关键问题】利用EMS对红缨子进行化学诱变，创制表型变异丰富的突变体库，以期改良红缨子株型、穗型和产量等性状，为开展调控酿造品质、产量等重要农艺性状基因的遗传定位及功能研究提供基础材料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为酒用糯高粱品种红缨子，由贵州省农业科学院旱粮研究所保存。EMS、磷酸盐缓冲液（PBS）和硫代硫酸钠（Na2S2O3）水溶液均购自北京索莱宝科技有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 EMS诱导处理 筛选籽粒饱满，均匀一致的红缨子籽粒10000粒，在通风橱中加入含有0.4% EMS的磷酸缓冲液（0.1 mol/L），种子完全被溶液浸没后，室温下混合振荡（50 r/min）处理14 h，诱变结束后加入0.1 mol/L Na2S2O3水溶液对废液进行中和处理，流水冲洗6 h后吸干水分，最终获得M1代突变种子。

1. 2. 2 突变群体种植及性状调查 在贵州农业科学院试验大田种植红缨子M1代突变种子，行距60 cm，株距20 cm，常规肥水管理，期间对M1代突变群体的突变情况进行调查鉴定。为提高M2代突变群体的突变频率，参照Jiao等（2016）的方法，M1代突变植株套袋自交后仅收获结实率小于30%的单株种子，并进行编号。种植红缨子M2代突变种子，每个突变株系种植20粒种子，行距60 cm，株距20 cm，常规肥水管理。参照张彬等（2019）的方法，以野生型植株为对照，对M2代突变群体的变异情况进行调查鉴定：每隔3～5 d进行一次田间调查，观察記录各突变株系的突变性状，记录不同生长时期（幼苗期、拔节期、抽穗开花期和成熟期）的突变特征及类型，统计突变频率。籽粒成熟后对M2代突变株系进行单株收获。

1. 3 统计分析

采用Excel 2010进行数据整理分析。田间存活率（%）=出苗数/播种的种子数×100，突变频率（%）=M2代突变株系/M1代突变群体株系数×100。

2 结果与分析

2. 1 EMS诱变处理结果

经EMS诱变处理后，红缨子M1代突变群体田间存活率降至31.9%，且出现了多种性状变异，如叶片白（黄）化、叶片畸形、穗畸形、植株矮化和不育等性状，最终获得结实率小于30%的M1代突变株系共1020个。种植M2代突变群体后，对各株系的表型和田间农艺性状（叶色、叶型、蜡质、生育期、穗型和育性等）进行调查统计，结果如表1所示。在M2代突变群体中发现86个突变株系，突变频率为8.43%。

2. 2 叶色突变体分析结果

EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中出现6种叶色突变类型，共42个株系。（1）白化突变体：共20个株系在幼苗期时叶片出现白化突变，无法光合作用而逐渐枯萎死亡（图1-A）。（2）黄化突变体：共12个株系在幼苗期叶片持续黄化，无法转绿，生长发育一段时间后逐渐枯萎直至死亡（图1-B）。（3）芯叶白化突变体：仅1个株系在幼苗期时芯叶出现白化现象，无法正常萌发新叶，植株生长一段时间后逐渐枯萎直至死亡（图1-C）。（4）浅绿色突变体：共6个株系在幼苗期时叶片较野生型浅，呈浅绿色，与白化突变体和黄化突变体相比，叶片中叶绿素含量较多，其中有4个株系从拔节期开始植株叶片逐渐转绿，至成熟期时与野生型叶片颜色无明显差异，另外2个株系的突变体叶片在整个生育期内始终保持浅绿色，无转绿现象发生，但能正常生长发育直至成熟（图1-D）。（5）条纹叶突变体：共3个株系，根据叶片条纹表型的不同，可分为两大类，第一类是叶片条纹呈白绿相间（图1-E），由于叶绿素含量较少，植株无法正常生长抽穗;第二类是叶片条纹呈黄绿相间（图1-F），植株能存活抽穗直至成熟。

2. 3 叶型突变体分析结果

EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中出现3种叶型突变类型，共8个株系。（1）畸形叶突变体：共5个株系叶片较野生型（图2-A）明显皱褶卷曲，且植株明显矮化，大部分植株无法正常生长发育（图2-B）。（2）卷曲叶突变体：仅1个株系大部分叶片较野生型明显卷曲下垂，其余性状与野生型基本一致（图2-C）。（3）直立叶突变体：共2个突变株系叶片在整个生育期直立上挺生长，且植株较野生型轻度矮化，茎秆节间长度明显缩短（图2-D）。

2. 4 穗型突变体分析结果

野生型植株穗型为侧散型，抽穗期时穗呈伞状，成熟期时整穗侧向一方下垂生长，平均穗长为35.5 cm（图3-A）。EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中出现3种穗型突变类型，共10个株系。（1）畸形穗突变体：共5个株系穗分支较短，抽穗期时旗叶无法正常展开，穗呈卷曲状（图3-B）或不规则散向四周（图3-C），4个株系出现不育，无法正常结实。（2）小穗突变体：共3个株系穗分支变短，平均穗长仅为10.5 cm，且结实率极低（图3-D）。（3）穗缺失突变体：共2个株系在幼苗期与拔节期能正常生长，但抽穗期时植株主茎和分蘖均无法正常孕穗，且株高较野生型明显降低。

2. 5 生育期突变体分析结果

以野生型植株为对照，调查EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中各株系生育期（抽穗期和成熟期）的突变情况，结果发现有3个株系提前8～15 d抽穗（图4-B），为早熟突变体，有2个株系延迟10～15 d抽穗，为晚熟突变体。以籽粒变硬、籽粒大小接近正常作为成熟期标志，经观察发现早熟突变体成熟期比野生型提前10～15 d，晚熟突变体的成熟期要比野生型延迟约10～20 d。

2. 6 蜡质缺失突变体分析结果

野生型植株茎秆表面有明显的白色蜡质层（图5-A），但EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中，共有4个株系出现蜡层缺失，在整个生育期内植株茎秆、叶片和叶鞘均无明显蜡层覆盖（图5-B），其中，有3个株系的蜡质缺失突变体在成熟期株高明显低于野生型，但其他农艺性状未出现明显变化。

2. 7 易感病突变体分析结果

128株野生型植株叶片均未出现明显的感病情况（图6-A），但EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中有4个株系易感病，具体又分为2种类型：第一类突变株系叶片从拔节期开始出现明显的大块褐斑，并伴有叶片局部坏死、枯萎现象，大部分叶片颜色与野生型基本一致（图6-B）;第二类突变株系从拔节期开始感病叶片上出现小褐斑，部分叶片上几乎布满了褐斑，且叶片颜色较野生型明显黄化（图6-C）。

2. 8 育性突变体分析结果

EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中出现完全不育突变和半不育突变两大类，共5个株系。（1）完全不育突变体：共有2个株系穗较野生型（图7-A）短且稀疏，推测因花粉育性降低而不能结实（图7-B）;（2）半不育突变体：共有3个株系穗结实率较野生型明显降低（图7-C）。

2. 9 株高突变体分析结果

野生型平均株高为260 cm。EMS诱变获得的红缨子M2代突变群体中，共鉴定到8个株高突变株系，可分为高杆和矮杆2种突变类型（图8）。（1）高杆突变体：共3个株系株高为341～364 cm，平均为352 cm。（2）矮杆突变体：共5个株系株高为179～192 cm，平均为185 m，较野生型下降28.8%，且部分矮杆突变体的茎节数并未减少，但茎秆节间长度较野生型明显缩短。

3 讨论

EMS作为一种化学诱变剂，已广泛应用于作物诱变育种中，其诱变原理是与DNA中的碱基发生反应，进而改变基因结构诱发相应的点突变。目前已成功构建水稻（Satoh and Omura，1981）、拟南芥（James and Dooner，1990）、大麦（Caldwell et al.，2004）、番茄（Watanabe et al.，2007）、小麦（Bovina et al.，2014）、黄瓜（Chen et al.，2018a）、玉米（Lu et al.，2018）、马铃薯（Somalraju et al.，2018）和谷子（Sun et al.，2019）等植物的EMS突变体库，筛选获得许多具有优良性状的种质资源。目前，相比水稻、玉米和小麦等其他禾本科作物，高粱EMS突变体库构建所使用品种较单一，针对酒用糯高粱构建其EMS突变体库的研究鲜见报道。本研究前期试验发现红缨子的最适诱变浓度为0.4%，较其他高粱品种（BTx623、晋粱5号和V4B）的最适诱变浓度高，可能与红缨子籽粒种皮较厚，耐受性高有关（范昕琦等，2020）。此外，由于红缨子的穗型和株型与其他高粱品種存在明显差异。因此，本研究中EMS诱变所获得的穗型和株型突变体也与其他高粱品种的EMS突变体也有所不同，后续可利用这些突变体对红缨子独特遗传变异进行深入研究。

叶色突变体是研究作物光合作用相关机理，如叶绿体生长发育、叶绿素的生物合成、代谢及调控等途径的理想材料。Zhu等（2019）对高粱野生型和白化致死突变体进行系统地蛋白质组学分析，结果发现，白化突变体中光合作用相关途径、部分次生代谢产物生物合成及核糖体代谢途径受到明显抑制。此外，叶色可作为颜色标记性状，在作物杂交育种和不育系加代中发挥作用。本研究筛选到芯叶白化突变体、黄化突变体、浅绿突变体、白绿相间条纹突变体和黄绿相间条纹突变体共6种叶色突变体，后续可对这些突变体遗传机理进行深入研究。

植物表皮蜡质层是其与外界环境交替的最后一道自我防护的防线，可提高植株抗旱、预防病虫害和抗射线等能力，在植物生存及生长发育中发挥重要的生理学和生态学功能。小麦、高粱、白菜和甘蔗等植物表面覆蓋有一层呈灰白色的蜡质，蜡质缺失会使植物表面的颜色变为亮绿色，肉眼清晰可见。目前，与其他模式植物（拟南芥、水稻和玉米）相比，已克隆的高粱蜡质相关基因较少，仅为高粱蜡质分泌的关键基因SbWBC11（Mizuno et al.，2013）、蜡质合成基因SbM39（Uttam et al.，2017）和SbM40（Jiao et al.，2018a）等。但有关高粱蜡质合成、运输、分泌和转录调控途径尚不清楚。本研究获得4个蜡质缺失突变体株系，以其为研究对象对深入挖掘蜡质相关基因，探究高粱蜡形成的分子机制具有重要意义。

株高常作为一个重要表型性状在作物育种中备受关注。目前，已在高粱中定位到多个控制株高的关键遗传位点，其中3个主效基因SbDw1、SbDw2和SbDw3已被成功克隆（Boyles et al.，2019）。由于红缨子株高较其他品种高，不耐密植，不利于大规模机械化生产，限制经济效益的提高。本研究共获得5个矮杆突变株系，今后应以其为研究对象，深入发掘株高相关基因，从而明确其调控机制及突变机理，并利用其培育矮杆糯高粱新品种，改善贵州酒用糯高粱主栽品种单一的现状，实现增产增收。

突变频率指某种特定的突变在整个诱变群体中所占的比例。一般情况下，使用的诱变剂剂量越大，则产生某种特定突变的频率就越高。本研究中高粱红缨子M2代突变群体的突变频率（8.33%）比Xin等（2008）构建的高粱BTx623M3代突变群体突变频率（63.3%）低，可能是由于在M2代突变群体中，突变性状大多以单株突变方式所表现，出现纯合突变株系的概率较小，部分株系还会出现世代分离，且由于环境的影响，部分突变性状会发生改变，因此需在不同环境中种植，观察突变性状的遗传稳定性。这些是构建EMS突变体库中需注意的关键问题，今后应对突变群体的性状进行重复鉴定。此外，本研究仅对M2代突变群体中田间表型性状明显突变的株系进行鉴定调查，未对籽粒品质（淀粉、单宁、脂肪和蛋白质含量）和抗逆（干旱、盐和重金属胁迫）等性状进行鉴定调查，因此下一步将会针对这些性状开展系统地鉴定工作，以期获得更多有利用价值的EMS突变体。

4 结论

构建的酒用糯高粱EMS突变体库突变类型丰富，可用于高粱功能基因组学研究和酒用糯高粱育种。

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（責任编辑 陈 燕）