向日葵盘精油的化学成分及抗氧化活性

何昶毅， 高潇涵， 李泽文， 刘玲玲， 孙彤彤， 陈小强,3*

(1.东北林业大学 生命科学学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.东北林业大学 化学化工与资源利用学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 3.西藏农牧学院 资源与环境学院， 西藏 林芝 860000)

向日葵(HelianthusannuusL.)为菊科(Compositae)向日葵属(Helianthus)一年生草本植物，又名丈菊，原产北美，我国各地均有栽培。通过人工培育，向日葵头状花序(葵盘)的大小、色泽产生许多变异，可供药用，也可作饲料及工业原料[1-2]。研究表明向日葵盘含有果胶[3-4]、酚类[5]、黄酮类[6]、多糖[7]、绿原酸[8]等多种生物活性成分，对心血管系统、高尿酸血症等多种慢性疾病具有辅助治疗作用[2,5]。向日葵盘作为食用或油用葵花籽生产过程中的主要副产物，我国每年产量约为8×105～10×105吨[5]，但多被当作饲料、烧柴甚至被废弃，不仅使得资源浪费而且造成环境污染。精油是从植物中提取的多种挥发性物质组成的液体混合物，抗氧化活性是其重要的生物活性之一[9]。尽管已有对不同产地和生长期的向日葵盘精油的化学成分研究报道[10-12]，但对于向日葵采收后的葵盘精油成分及其体外抗氧化活性的研究未见报道。因此，本研究采用水蒸气蒸馏法提取葵花籽采收后的向日葵盘精油，采用GC-MS法对其化学成分进行分析，并对精油的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力进行评价，以期为向日葵盘的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

向日葵盘(葵花籽采收后)于2018年9月采自黑龙江省兰西县，经东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室鉴定为向日葵(HelianthusannuusL.)的葵盘。C8～C20正构烷烃标准品、 2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH)、 2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二铵盐(ABTS)、二丁基羟基甲苯(BHT)，美国Sigma-Aldrich公司；过硫酸钾、甲醇等其他试剂均为分析纯。

FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；HP 6890/5973NMSD气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent Technologies公司；Infinite M200酶标仪，瑞士Tecan Group公司；752N紫外-可见分光光度计，上海精科实业有限公司。

1.2 向日葵盘精油的提取

将室温干燥至质量恒定的向日葵盘进行粉碎并过0.90 mm筛。准确称取100.0 g向日葵盘粉置于圆底烧瓶中，加入少许沸石和1 000 mL超纯水，采用水蒸气蒸馏法提取向日葵盘精油5 h，使用无水硫酸钠对得到的精油进行干燥处理，-20 ℃储存，待测备用。

1.3 精油的GC-MS分析

GC条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，载气流量为1.0 mL/min，进样量为0.02 μL，进样口温度280 ℃，分流比10 ∶1。程序升温：从50 ℃开始，以5 ℃/min升温到230 ℃，再以8 ℃/min升温到280 ℃，保持5 min。MS条件：EI源，电离电压70 eV，离子源温度230 ℃，溶剂延迟3.0 min，扫描范围(m/z)5～400。检索谱库：NIST 02。最后用峰面积计算各成分的GC含量。

1.4 精油的抗氧化活性测定

1.4.1DPPH自由基清除能力 采用微板法测定精油的DPPH自由基清除能力[13]。配制系列质量浓度(0.062 5、 0.125、 0.25、 0.5和1.0 g/L)的精油样品溶液，取样品溶液20 μL加入96孔板中，再加入0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液180 μL，混匀，置于酶标仪中室温避光孵化30 min，于517 nm处测定吸光度(A样品+DPPH·)。以甲醇代替样品溶液，同法测得吸光度(A空白)。取样品溶液20 μL加入96孔板中，再加入甲醇180 μL，置于酶标仪中室温避光孵化30 min，于517 nm 处测定吸光度(A样品)。以BHT为阳性对照，进行3组平行试验，取平均值。DPPH自由基清除率(ηDPPH·)按式(1)计算：

ηDPPH·=(1-A样品+DPPH·+A样品)/(ADPPH·-A空白)×100%

(1)

根据精油质量浓度和DPPH自由基清除率，计算精油样品处理DPPH自由基清除率为50%时对应的半数有效浓度(EC50值)。

1.4.2ABTS自由基清除能力 依据文献[14]测定精油的ABTS自由基清除能力。取7 mmol/L ABTS储备液与2.45 mmol/L过硫酸钾储备液按体积比1 ∶0.5混合均匀，室温避光静置16 h，得到ABTS自由基母液。ABTS自由基母液用乙醇稀释配制成工作液，使其在波长734 nm处吸光度为0.70±0.02。在2.40 mL ABTS工作液中加入0.1 mL系列质量浓度(0.05、 0.1、 0.2、 0.4和0.8 g/L)的精油样品溶液，混匀，30 ℃ 暗反应6 min，于波长734 nm处测定吸光度(A样品)，同时测定空白对照(ABTS溶液)在734 nm下的吸光度(A空白)。以BHT为阳性对照，进行3组平行试验取平均值。ABTS自由基清除率(ηABTS+·)按式(2)计算：

ηABTS+·=(A空白-A样品)/A空白×100%

(2)

根据精油质量浓度和自由基清除率，计算精油样品处理ABTS自由基清除率为50%时对应的半数有效浓度(EC50值)。

2 结果与讨论

2.1 向日葵盘精油的化学成分分析

GC-MS法分析了向日葵盘精油样品的组成及其GC含量，总离子流色谱图见图1。利用C8～C20正构烷烃和保留时间计算精油各组分的保留指数(IR)，结合NIST质谱库和文献中各组分的保留指数对化合物进行鉴定，结果见表1。

图1 向日葵盘精油的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of the essential oil from H. annuus heads

由表1可知，向日葵盘精油中共鉴定出49种化合物，占精油总量的91.16%。其中α-蒎烯(28.22%)、柠檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合欢烯(3.58%)和莰烯(3.39%)为精油的主要成分,占精油总量的46.73%。鉴定成分中单萜类化合物占44.26%，氧化单萜类化合物占10.92%，倍半萜类化合物占20.78%，氧化倍半萜类化合物占14.70%，其他类化合物占0.50%。

张玲玲等[10]对广东产新鲜向日葵花盘的挥发油成分进行了GC-MS分析，共鉴定出29种化合物，其中含量较高的成分为α-蒎烯(21.95%)、桧烯(15.66%)、β-蒎烯(4.03%)、白菖油萜(3.29%)和大根香叶烯D(3.62%)。索金玲[11]利用气质联用技术对新疆产向日葵花盘挥发油进行研究，从花期挥发油中鉴定出39种成分，主要成分有α-松萜(55.24%)、β-水芹烯(5.77%)、白菖油萜(5.91%)、4-松油醇(3.19%)；成熟期挥发油中鉴定出36种成分，主要成分有α-松萜(41.78%)、白菖油萜(14.22%)、β-红没药烯(2.97%)，其中17种化合物为二者共有，以α-松萜(α-蒎烯)、白菖油萜为主。Ceccarini等[12]对处于花期的2种意大利产向日葵的叶和花盘精油进行了研究，其中花盘精油的主要成分有α-蒎烯(57.1%～60.0%)、桧烯(19.8%～20.2%)、β-蒎烯(6.8%～7.2%)、柠檬烯(5.1%～6.9%)、大根香叶烯D(6.0%～6.3%)、乙酸异龙脑酯(5.2%～6.0%)、莰烯(4.9%～5.2%)。与上述文献对比，本研究中α-蒎烯仍为精油的最大量成分，说明从花期至采收后期，该成分在向日葵盘中的含量较为丰富且稳定。相较文献[11]成熟期的向日葵花盘精油成分，采收后鉴定出的相同化合物且GC含量大于1%的还有莰烯。此外，由于实验原料产地、采收季节、提取方法及分析条件等不尽相同，不同研究结果间也存在一定差异。

2.2 向日葵盘精油的体外抗氧化活性

表1 向日葵盘精油的化学成分

合计 total91.16

图2 向日葵盘精油对DPPH和ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of essential oil from sunflower head on DPPH· and ABTS·

向日葵盘精油与阳性对照BHT对DPPH自由基清除活性的半数有效浓度(EC50)值分别为(0.47±0.12) g/L和(8.21±0.15) mg/L。

Mehmood等[5]研究了向日葵盘乙醇提取物的DPPH自由基清除作用，结果表明：在5 ∶1～50 ∶1的液固比条件下，得到的每克提取物针对DPPH自由基的抗氧化活性相当于657.17～942.02 μg Trolox。马雪梅等[15]研究结果表明：向日葵盘果胶<10 ku级分对DPPH自由基的清除效果最好，样品质量浓度为6.4 g/L时最大清除率达92.78%。在食品工业中，部分植物精油因具有良好的抗氧化作用而被认为是人工合成抗氧化剂的优良替代品[16]。由本研究结果可见，采收后向日葵盘精油对DPPH自由基具有一定清除能力，但其EC50值为(0.47±0.12) g/L大于阳性对照BHT的(8.21±0.15) mg/L。酚类化合物被认为是精油抗氧化活性的物质基础之一[17]。向日葵盘精油主要成分为α-蒎烯(28.22%)、柠檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)等非酚类化合物，这可能是其抗氧化活性较弱的原因[18]。需要指出的是，也有研究显示，γ-萜品烯等非酚类成分含量较高的精油也具有较好的体外抗氧化活性，但相关机制尚不清晰[19]。

ABTS法较DPPH法适用于更多类型的抗氧化活性物质筛选[20]，且ABTS法对亲脂性和亲水性抗氧化物均适用[21]。虽然ABTS法和DPPH法具有相同的反应机理，但ABTS法得到的EC50值要小于DPPH法，这是因为精油中抗氧化活性成分与DPPH和ABTS反应的化学计量比不同，位阻因素和侧链双键的谐振作用亦使DPPH自由基更稳定[22]。向日葵盘乙醇提取物的ABTS自由基清除作用研究发现，在5 ∶1～50 ∶1的液固比条件下，得到的每克提取物针对ABTS自由基的抗氧化活性相当于773.35～902.02 μg Trolox[5]。向日葵盘精油对ABTS自由基清除作用尚未见文献报道，本研究发现二者呈现明显的质量浓度依赖性，质量浓度为0.8 g/L时精油的ABTS自由基清除率为89.70%，但其EC50值为(0.30±0.08) g/L仍大于阳性对照BHT的(6.16±0.13) mg/L，与DPPH法的研究结果一致。

3 结 论

对采收后向日葵盘精油的成分及其体外抗氧化活性进行了研究。通过GC-MS分析，共鉴定出49种化学成分(占精油总量91.16%)，其主要成分有α-蒎烯(28.22%)、柠檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合欢烯(3.58%)和莰烯(3.39%)。体外抗氧化活性研究发现：向日葵盘精油具有一定的体外抗氧化活性，其清除DPPH、ABTS自由基的半数有效浓度(EC50)值分别为0.47、 0.30 g/L，大于阳性对照BHT，具体活性组分仍有待进一步研究。